[發明專利]一種低成本的AML1-ETO融合基因快速檢測探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710123226.4
• 申請日: 2017-03-03
• 公開（公告）號: CN106834493B
• 公開（公告）日: 2018-06-26
• 發明（設計）人: 呂玉琦;李雪梅;葉倫;程弘夏;陳剛
• 申請（專利權）人: 武漢康錄生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6811;C12Q1/6841;C12N15/11;C12N15/10;G06F19/20
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 鄔麗明;徐曉琴

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種低成本的AML1?ETO融合基因快速檢測探針及其制備方法。所述制備方法包括以下步驟：從UCSC Genome Browser下載AML1和ETO基因探針所覆蓋區域基因組非重復序列，再將分割后的序列批量導入OligoArray軟件進行探針設計，然后將設計后的探針加上標簽序列后直接合成，再使用帶有熒光基團的標簽引物對探針進行擴增和標記，得到AML1?ETO融合基因快速檢測探針。本發明制備所得AML1/ETO融合基因快速檢測探針具有雜交時間短(可在15～30分鐘完成雜交實驗)、雜交信號明亮、信噪比高、制備成本低等優點。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種低成本的AML1-ETO融合基因快速檢測探針及其制備方法和應用。

背景技術

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一種常見的造血系統的惡性腫瘤，目前在我國惡性腫瘤的總體死亡率中，急性髓系白血病位居前列。AML中最常見的染色體易位為t(8；21)(q22；q22)，在所有AML中t(8；21)易位的發生率可達10-15％，在FAB M2型AML中其發生率可達40％～50％，在M2b型AML發生率可高達80％，少見于M0、Ml和M4型白血病中。t(8；21)易位涉及急性粒細胞白血病基因(AML1基因，也稱為RUNX1基因)和ETO基因(也稱為RUNX1T1基因)，并形成AML1/ET0融合基因。在臨床上，AML1/ET0融合對急性白血病的預后、化療及病人的生存時間等判斷提供依據。目前最常見的檢測方法是核型分析，但由于白血病細胞特性的影響，染色體分裂相少且難以得到長度適中的染色體中期分裂相，使得難以判斷是否存在斷裂易位。這種情況下，FISH檢測具有敏感，特異，高效和重復性好的特點。因此，FISH可用于急性髓系白血病t(8；21)(q22；q22)(AML1/ETO)診斷。

熒光原位雜交是一種在20世紀80年代放射性原位雜交技術基礎上發展起來的一種非放射性分子遺傳技術，以熒光素標記取代放射性同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。目前FISH常用的檢測探針主要是通過對特定人類基因組BAC克隆進行缺口平移法或隨機引物法標記，再經COT-1DNA封閉后用于原位雜交實驗，但此方法包含大量的重復序列即使經過COT-1DNA封閉但雜交結果仍具有較高的背景，并且此種方法標記的探針通常需要12-16h(過夜)來完成雜交實驗，費時費力，并且此種方法需要大量(通常是探針濃度的50～100倍)昂貴的COT-1DNA來進行重復序列封阻，這大大的增加了探針的制備成本。此外近年來一種不含重復序列的快速熒光原位雜交探針的制備方法也被建立起來(1h完成雜交實驗)，但此種方法需要設計大量引物或者構建大量載體來實現探針的制備，并且探針的制備過程仍采用缺口平移或隨機引物等傳統方法，導致批次間的不穩定；此外此種制備方法仍然需要依賴于人類基因組序列或者BAC克隆序列，原料來源具有一定局限性，并且整個制備過程繁瑣，制備成本和不可控因素大大增加。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，目的在于提供一種低成本的AML1-ETO融合基因快速檢測探針及其制備方法和應用。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種低成本的AML1-ETO融合基因快速檢測探針的制備方法，包括如下步驟：

(1)從UCSC Genome Browser下載AML1和ETO基因探針所覆蓋區域的基因組非重復序列，其中AML1探針覆蓋區域為：chr21:34787801-35049334，ETO探針覆蓋區域為：chr8:91954967-92103365；

(2)將步驟(1)獲得的AML1基因探針所覆蓋區域的基因組非重復序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的區塊；將分割后的區塊批量導入OligoArray軟件進行探針設計、探針篩選，然后將篩選出的探針導出到EXCEL表格中，再分別在每條探針的5’端和3’端加上18bp的標簽序列，得到一系列帶有標簽序列的AML1探針序列；