[發明專利]高效增殖桿狀病毒的昆蟲細胞株及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201710122391.8
• 申請日: 2017-03-03
• 公開（公告）號: CN107488633B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 吳培培;馮磊;唐應華;陳麗;惲君雯;侯繼波
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N7/00;C12N15/866;C12R1/93
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 張慧清

本發明公開了一種高效增殖桿狀病毒的昆蟲細胞株，該昆蟲細胞株名稱為Sf9?op?BmBDV?NS1，于2016年11月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC），保藏編號為CGMCC NO.13289，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。該細胞株能夠顯著提高外源蛋白的表達量，其表達的外源病毒蛋白或病毒樣顆粒產物具有較強的生物活性，符合疫苗的生產要求；經過外源病毒檢測、支原體檢測、無菌檢測、外源因子檢測后，該細胞株的各種指標均符合疫苗生產用細胞基質的要求；可應用于桿狀病毒和疫苗的生產。

技術領域

本發明涉及昆蟲細胞株，具體涉及高效增殖桿狀病毒的昆蟲細胞株及其構建方法和應用，屬于基因工程、細胞工程技術領域。

背景技術

桿狀病毒表達系統( baculovirus expression vector system，BEVS) 是將外源基因整合到桿狀病毒基因組上形成重組桿狀病毒，在昆蟲細胞或蟲體中表達外源蛋白的一種真核表達系統，它被越來越多地應用于表達生產抗體、受體、基因疫苗以及重組藥物蛋白等方面。與原核表達系統相比，桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統具有翻譯后修飾的能力；而與哺乳動物細胞表達系統相比，桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統表達效率高。

在眾多昆蟲細胞株中，草地夜蛾卵巢細胞(Spodopterafrugiperda，Sf9)是常用來表達重組蛋白的昆蟲細胞株。它既可以貼壁培養也可以懸浮培養，并可以在無血清培養基中生長良好，因此是大規模培養生產，增殖重組外源蛋白的常用昆蟲細胞株。

由于桿狀病毒感染昆蟲細胞會引起昆蟲細胞的裂解與凋亡，因此昆蟲細胞的生長狀態對于重組桿狀病毒增殖十分重要，是重組蛋白獲得高產量的重要條件之一。

發明內容

本發明的主要目的是公開一種昆蟲細胞株及其構建方法，該昆蟲細胞株具有良好的生長狀態，能夠滿足重組蛋白高產量表達的需要。

為了實現這一目的，我們公開了一種高效增殖桿狀病毒的昆蟲細胞株，該昆蟲細胞株名稱為Sf9-op-BmBDV-NS1，于2016年11月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC），保藏編號為CGMCC NO.13289，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

該昆蟲細胞株中攜帶有重組優化的家蠶二分濃核病毒（Bombyx moribidensovirus, BmBDV）的NS1蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明所公開高效增殖桿狀病毒的昆蟲細胞株的構建方法是將經過優化的NS1基因插入已知的表達載體，并將這一載體轉染Sf9細胞后，通過抗性篩選獲得穩定表達NS1蛋白的重組昆蟲細胞株Sf9-op-BmBDV-NS1。具體包括以下步驟：

（1）由BmBDV病毒中獲得NS1 基因，并通過對其優化獲得op-BmBDV-NS1基因；

（2）將所獲得的op-BmBDV-NS1基因插入已知表達載體，從而獲得重組表達載體；

（3）用重組表達載體轉染Sf9細胞；

（4）博來霉素Zeocin抗性篩選獲得穩定表達NS1蛋白的重組昆蟲細胞株Sf9-op-BmBDV-NS1。

其中步驟（2）可以進一步描述為：將所述基因op-NS1插入pIZT-V5/His載體，轉化入DH5ɑ感受態細胞，采用抗生素平板篩選獲得重組子，將該重組子進行酶切、電泳，鑒定為陽性的重組子所含有的重組質粒即為重組轉移載體pIZT-V5/His-op-BmBDV-NS1；

同時，進一步地，步驟（3）中pIZT-V5/His-op-BmBDV-NS1 載體通過CellfectinⅡ轉染Sf9昆蟲細胞。