[發明專利]多重熒光定量PCR的方法

有效

• 申請號: 201710121610.0
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN106868140B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 虞之龍;劉玚;邱海維
• 申請（專利權）人: 北京酷搏科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 趙囡囡;吳貴明

1.一種多重熒光定量PCR的方法，其特征在于，所述方法包括：

將多個目標片段的擴增引物對置于同一擴增體系中進行PCR擴增，所述PCR擴增包括N輪PCR熱循環，10≤N≤50，且所述同一擴增體系中包括雙鏈DNA染料；

每一輪PCR熱循環后，對PCR產物進行程序升溫；

在對所述PCR產物進行程序升溫的過程中，對所述PCR產物的熒光強度進行采集，從而獲得所述多個目標片段形成的混合片段的熔解曲線；

建立各單一目標片段的熔解曲線，利用公式(1)對各所述單一目標片段的熔解曲線進行擬合；

將各所述單一目標產物的熔解曲線的擬合公式進行疊加，得到所述公式(2)；

在所述公式(1)中，x表示溫度，y表示觀測到的相對熒光強度，參數a表示對應的單一目標片段的含量所對應的熒光強度，參數b表示對應的單一目標片段產物的熒光強度隨溫度線性變化的系數，參數c表征對應的單一目標片段在溫度為Tm±5℃范圍內熒光強度的下降速率，參數d表示背景熒光強度，參數Tm表示對應的單一目標片段的熔解溫度，e為自然常數；

在所述公式(2)中，x表示溫度，y表示觀測到的相對熒光強度，n表示目標片段的數量，n為≥2的整數，i為自然數，參數a_i表示第i個的目標片段的含量所對應的熒光強度，參數b_i表示第i個目標片段的熒光強度隨溫度線性變化的系數，參數c_i表征第i個目標片段在溫度為Tm_i±5℃范圍內熒光強度的下降速率，參數d表示背景熒光強度，參數Tm_i表示第i個目標片段的熔解溫度，e為自然常數；

利用公式(2)對所述混合片段的熔解曲線進行擬合的方式，計算所述每一輪PCR熱循環后各單一目標片段的含量，進而建立各單一目標片段的含量隨PCR熱循環次數增加而變化的擴增曲線；

根據各單一目標片段的擴增曲線計算得到各單一目標片段對應的Ct值，進而根據所述Ct值計算得到各單一目標片段的起始濃度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述程序升溫是按照0.5～10℃/s的升溫速率從起點溫度升至終點溫度。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述起點溫度為40～90℃，所述終點溫度為60～100℃。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，對所述PCR產物的熒光產物進行采集的速率為0.2～100點/秒。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，建立各單一目標片段的熔解曲線的步驟包括：利用各單一目標片段對應的單一引物對進行PCR擴增，所述PCR擴增包括N輪PCR熱循環，10≤N≤50，其中，每一輪PCR熱循環的步驟包括：85～100℃的解鏈以及解鏈之后的40～75℃的延伸。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，在最后一輪PCR熱循環后，采集各單一目標片段的PCR產物的熒光強度，建立各所述單一目標片段的熔解曲線。