[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因水稻多重?cái)?shù)字PCR定量檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710117885.7
• 申請(qǐng)日: 2017-03-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106868137B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪小福;徐俊鋒;陳笑蕓;彭城;徐曉麗;魏巍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京思元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

1.用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、M12、TT51-1 和G6H1的多重?cái)?shù)字PCR 定量方法，其特征在于，包括：

（1）提取待檢測(cè)水稻樣品的DNA；（2）以提取的DNA 為模板，以多重?cái)?shù)字PCR 定量檢測(cè)引物對(duì)和探針，以及水稻內(nèi)參基因檢測(cè)引物對(duì)和探針建立數(shù)字PCR 體系并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；所述水稻內(nèi)參基因?yàn)樗菊崽橇姿崦富颍唬?）對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算外源基因拷貝數(shù)與內(nèi)參基因拷貝數(shù)之比，獲得轉(zhuǎn)基因成分的定量值；

所述的多重?cái)?shù)字PCR 定量檢測(cè)引物對(duì)和探針由以下引物對(duì)和探針組成：

由核苷酸序列為SEQ ID No.1 所示上游引物和SEQ ID No.2 所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KF2 轉(zhuǎn)化體特異性引物對(duì)；轉(zhuǎn)基因水稻KF2 轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.3 所示；

由核苷酸序列為SEQ ID No.4 所示上游引物和SEQ ID No.5 所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KF6 轉(zhuǎn)化體特異性引物對(duì)；轉(zhuǎn)基因水稻KF6 轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.6 所示；

由核苷酸序列為SEQ ID No.7 所示上游引物和SEQ ID No.8 所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KF8 轉(zhuǎn)化體特異性引物對(duì)；轉(zhuǎn)基因水稻KF8 轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.9 所示；

由核苷酸序列為SEQ ID No.13 所示上游引物和SEQ ID No.14 所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻M12 轉(zhuǎn)化體特異性引物對(duì)；轉(zhuǎn)基因水稻M12 轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.15 所示；

由核苷酸序列為SEQ ID No.16 所示上游引物和SEQ ID No.17 所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1 轉(zhuǎn)化體特異性引物對(duì)；轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.18 所示；以及，

由核苷酸序列為SEQ ID No.19 所示上游引物和SEQ ID No.20 所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻G6H1 轉(zhuǎn)化體特異性引物對(duì)；轉(zhuǎn)基因水稻G6H1轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.21 所示；

所述水稻內(nèi)參基因檢測(cè)引物對(duì)由核苷酸序列為SEQ ID No.22 所示上游引物和SEQ IDNo.23 所示下游引物組成；所述水稻內(nèi)參基因探針的核苷酸序列為SEQ ID No.24 所示。

2.按照權(quán)利要求1所述的多重?cái)?shù)字PCR 定量方法，其特征在于，所述數(shù)字PCR 體系為：反應(yīng)體系的總體積為20μL，其中，2xddPCR Supermix for probe 10μL，所述多重?cái)?shù)字PCR定量檢測(cè)引物對(duì)和探針以及水稻內(nèi)參基因檢測(cè)引物對(duì)和探針組成的引物與探針的混合物6μL，DNA 模板4μL。

3.按照權(quán)利要求2所述的多重?cái)?shù)字PCR 定量方法，其特征在于：所述引物與探針的混合物中，水稻內(nèi)參基因檢測(cè)引物對(duì)的上、下游引物濃度均為3000 nmol/L，水稻內(nèi)參基因探針的濃度為600 nmol/L，所述多重?cái)?shù)字PCR 定量檢測(cè)引物對(duì)的上、下游引物濃度均為1500nmol/L，所述多重?cái)?shù)字PCR定量檢測(cè)探針的濃度均為300 nmol/L。

4.按照權(quán)利要求1所述的多重?cái)?shù)字PCR 定量方法，其特征在于，所述PCR 擴(kuò)增的程序包括：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 sec， 60℃退火及延伸60 sec，共40 個(gè)循環(huán)；98℃ 10min。

5.按照權(quán)利要求1所述的多重?cái)?shù)字PCR 定量方法，其特征在于，所述水稻內(nèi)參基因探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)HEX，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1；

所述多重?cái)?shù)字PCR 定量檢測(cè)探針的5’端均標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’端均標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。