[發明專利]防治仔豬腹瀉的益生菌制劑及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710117883.8
• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN107050064A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 晏向華;胡軍;聶楊帆
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: A61K35/747
• 分類號: A61K35/747;A61P1/12
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司42104
• 代理人: 樊戎,馮超

技術領域

本發明涉及防治仔豬腹瀉的生物制劑，具體地指一種防治仔豬腹瀉的益生菌制劑及其制備方法和應用。

背景技術

仔豬由于免疫系統發育不完善，在受到外界刺激時易發生腹瀉。尤其是仔豬的早期斷奶措施會從營養、心理和環境等方面刺激仔豬，導致仔豬發生早期斷奶應激，嚴重時引起仔豬發生腹瀉甚至死亡。生產實踐中廣泛使用抗生素來緩解仔豬腹瀉，但隨著抗生素的耐藥性和食品安全等問題的日益突出，禁用抗生素已經成為一種必然趨勢。

目前常用益生菌制劑來部分替代豬用抗生素的使用。如何挖掘新型高效的防治仔豬腹瀉的益生菌制劑成為當前的研究熱點。

發明內容

本發明的目的是提供了一種防治仔豬腹瀉的益生菌制劑及其制備方法和應用；該益生菌制劑由Lactobacillus frumenti菌株制備而成，用于防治仔豬腹瀉，具有顯著的效果，從而可以在防治仔豬腹瀉過程中減少豬用抗生素的使用量。

為解決上述技術問題，本發明提供的一種防治仔豬腹瀉的益生菌制劑，所述益生菌制劑由Lactobacillus frumenti菌株制備而成，其中，每毫升益生菌制劑中總活菌數量為10¹～10²⁰個。

進一步地，所述益生菌制劑中，總活菌數量為10³～10¹⁵個/ml。

本發明還提供了一種上述防治仔豬腹瀉的益生菌制劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將Lactobacillus frumenti接種到新鮮的液態培養基中進行培養，得到細菌懸液；

2)將制得的細菌懸液離心獲取細菌沉淀，用磷酸鹽緩沖液PBS重懸細菌沉淀，將活菌懸液混合均勻，得到益生菌制劑；其中，每毫升益生菌制劑中總活菌數量為10¹～10²⁰個。

進一步地，所述益生菌制劑中，總活菌數量為10³～10¹⁵個/ml。

本發明還提供了一種上述防治仔豬腹瀉的益生菌制劑在防治仔豬腹瀉中的應用。將益生菌制劑灌服至仔豬胃中，灌服劑量為1～10毫升/次，日服一次。

上述Lactobacillus frumenti菌株購于日本微生物菌種保藏中心(JCM)。Lactobacillus frumenti細菌最早于2000年在黑麥麩發酵培養物中被分離并鑒定，然而該細菌至今尚未被報道有防治仔豬腹瀉的效果。

如需長途運輸或者長期存放，為了保持益生菌制劑中菌的活性，可以使用以下方法：

向制得的菌液中加入甘油得到細菌凍存液(甘油的體積分數為10％)，置于液氮中低溫保存。使用前通過37℃水浴快速解凍菌液，然后將制得的細菌懸液離心獲取細菌沉淀，用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細菌沉淀得到益生菌制劑。其中，每毫升益生菌制劑中活菌數量為10¹～10²⁰個，優選為10³～10¹⁵個。

本發明的有益效果在于：

本發明的益生菌制劑制作過程簡單，生產成本較低，具有顯著的防治仔豬腹瀉效果。

具體實施方式

為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但本發明的內容不僅僅局限于以下實施例。

益生菌制劑的制備方法為：

1)通過37℃水浴快速復蘇液氮凍存的Lactobacillus frumenti菌液，接種到新鮮的液態培養基中富集培養。待液態培養基變渾濁，用接種環沾取適量菌液劃線接種于固態培養基中。固態培養基中長出單菌落后，挑取單菌落接種到新鮮的液態培養基中富集培養。待液態培養基變渾濁，提取菌液中細菌基因組DNA，PCR擴增16S rDNA全長并純化回收。將回收的16S rDNA片段送至測序公司進行測序，經測序結果與NCBI數據庫進行比對，驗證挑取的單菌落是否為Lactobacillus frumenti菌株。將經測序比對驗證成功的菌液接種到新鮮的液態培養基擴大培養。采用活菌計數法對菌液中的活菌計數，并根據計數結果將菌液中的活菌數量調整為10¹～10²⁰個/毫升，向菌液中加入甘油得到細菌凍存液(甘油的體積分數為10％)，置于液氮中低溫保存；