[發(fā)明專利]用于檢測人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物、探針、試劑盒及方法

在審

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• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN106702005A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭仲征;安琳;芮立;尤開
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳荻碩貝肯精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)有限公司;上海荻碩貝肯醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司;上海荻碩貝肯生物科技有限公司;上海荻碩貝肯生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

華法林是臨床上常用的抗凝藥物，是深靜脈血栓、心房纖顫、心臟瓣膜置換術(shù)和肺栓塞等疾病的一線用藥。但是華法林治療窗很窄：藥劑量小了，不能阻止血栓形成；劑量大了，又會導(dǎo)致出血，患者的最適用藥量表現(xiàn)出明顯的個體差異。目前已知與華法林藥動學(xué)和藥效學(xué)相關(guān)基因達(dá)30余種，其中維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1(Vitamin K epoxidereductase complex subunit 1，VKORC1)和細(xì)胞色素P450 2C9(CytochromeP450 2C9，CYP2C9)基因多態(tài)性是華法林個體劑量差異的主要影響因素。

CYP2C9基因存在野生型CYP2C9*1和突變型CYP2C9*2～CYP2C9*13，其中與華法林代謝最密切的突變型為CYP2C9*2(rs1799853)和CYP2C9*3(rs1057910)，這2個位點(diǎn)的突變導(dǎo)致CYP2C9活性降低。CYP2C9*2型等位基因在中國人中極少發(fā)現(xiàn)，CYP2C9*3型的頻率為3％。CYP2C9*3純合子和雜合子基因型個體S-華法林的口服清除率分別下降了90％和66％，因此按常規(guī)劑量給藥會造成華法林血藥濃度長時間維持在較高水平，導(dǎo)致患者出血風(fēng)險(xiǎn)增加。維生素k氧化還原酶(VKORC1)是華法林的作用靶點(diǎn)，VKORC1在其啟動子區(qū)存在-1639G>A位點(diǎn)多態(tài)性(rs9923231)。大量研究發(fā)現(xiàn)，VKORC1啟動子的基因多態(tài)性是影響華法林需求劑量中種族差異和個體差異的最主要因素。與該位點(diǎn)AA基因型患者相比，-1639GA和GG基因型患者平均華法林劑量分別增加52％和102％。美國FDA 2010年修改華法林說明書，建議結(jié)合VKORC1和CYP2C9基因型考慮華法林的初始用藥劑量。臨床上也可根據(jù)考慮了VKORC1和CYP2C9基因型、年齡、身高、體重、種族、是否合用肝藥酶誘導(dǎo)劑和是否合用胺碘酮等因素的劑量計(jì)算公式確定華法林初始用藥劑量。

目前臨床應(yīng)用的基因多態(tài)性檢測方法主要有四種：直接測序法，PCR-基因芯片法，PCR-溶解曲線法和熒光定量PCR法。測序法雖然為基因多態(tài)性檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是由于其需要的檢測時間長，操作復(fù)雜，并且靈敏度不高；PCR-基因芯片法的操作要求高，雜交和洗片都必須避光操作，并且芯片價格昂貴；PCR-溶解曲線法無特異性，并不能精確定位基因變化位置，并且只是因單個堿基差異造成的Tm差異不是很明顯，通常會造成在溶解曲線上的峰不是很清晰，因而這三種方法在臨床上的推廣都存在一定困難。傳統(tǒng)熒光定量PCR法在臨床上應(yīng)用較為廣泛，該方法對樣本數(shù)量以及多態(tài)性分布有一定要求，樣本量少時不能對樣本基因多態(tài)性進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，對于檢測人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性還無法滿足高效、精準(zhǔn)、簡便等要求，同時還需要對樣品進(jìn)行基因組DNA提取等繁瑣復(fù)雜的操作流程，所以亟需一種快速、有效、精準(zhǔn)且無需DNA提取的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，基于最新的科研動態(tài)和臨床應(yīng)用，重新設(shè)計(jì)了用于檢測人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物、探針以及方法。本發(fā)明的檢測方法簡便快速、精準(zhǔn)有效、結(jié)果簡單易辨別且對于小樣本依然適用，甚至直接利用血液樣品或?yàn)V紙干血片樣品為模板進(jìn)行檢測也能得到很好的結(jié)果。

為此，本發(fā)明一方面提供了一種用于檢測人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物和探針組合，其中引物序列如序列1-4所示，探針序列如序列5-8所示，引物序列1-2以及探針序列5-6用于檢測VKORC1基因的多態(tài)性，引物序列3-4以及探針序列7-8用于檢測CYP2C9基因的多態(tài)性。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，該引物和探針組合中，探針的5’端有FAM或VIC修飾，3’端有NFQ-MGB修飾。

在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該引物和探針組合中，每條引物的濃度為300nM，每條探針的濃度為200nM。

本發(fā)明基于最新的科研動態(tài)和臨床應(yīng)用，重新設(shè)計(jì)了用于檢測人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物和探針。所設(shè)計(jì)的引物Tm值均在60℃附近，整合搭配各個引物，從而盡量避免了引物二聚體的產(chǎn)生。同時選用MGB探針使得Tm值均在70℃附近，避免了探針與其他非特異性序列之間的結(jié)合，同時也避免了探針相互之間形成復(fù)雜的二聚體，提高了熒光PCR擴(kuò)增的特異性和效率。

針對人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的檢測，本發(fā)明設(shè)計(jì)的具體引物和探針情況如表1和表2所示。