[發(fā)明專利]一種復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710116966.5
• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN106916851A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳凌;馮立強(qiáng);李楚芳;孫西魁
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州恩寶生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;A61K39/235;A61K39/42;A61K48/00;A61P31/20
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司44102
• 代理人: 鄧義華

1.一種復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體，其特征在于，由如下方法制備得到：將Ad14基因組質(zhì)粒化，敲除其E3和E1基因，進(jìn)而將其E4基因開放閱讀框2、3、4、6、6/7改換為Ad5基因組的相應(yīng)閱讀框。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體，其特征在于，還在Ad14的E1基因區(qū)域整合外源基因表達(dá)框。

3.權(quán)利要求1或2所述的復(fù)制缺陷型人14型腺病毒載體的制備方法，其特征在于，包含如下步驟：

S1.PCR擴(kuò)增獲得Ad14基因組的左右兩端，連接至氨芐抗性質(zhì)粒得到pT-Ad14(L+R)，線性化后與Ad14基因組重組，得到基因組質(zhì)粒pAd14；

S2.PCR擴(kuò)增獲得Ad14 E3基因的左右臂并反向連接至卡那霉素抗性質(zhì)粒，線性化后與部分酶切線性化的pAd14同源重組，得到去除E3基因的基因組質(zhì)粒pAd14ΔE3-Kana；

S3.PCR擴(kuò)增Ad14 E3基因的左右臂并同向連接到卡那霉素抗性質(zhì)粒上，線性化后與線性化的pAd14ΔE3-Kana進(jìn)行重組，得到去除卡那抗性基因的基因組質(zhì)粒pAd14ΔE3；

S4.PCR擴(kuò)增Ad14 E1基因的左右臂并反向連接至卡那霉素抗性質(zhì)粒，線性化后與部分酶切線性化的pAd14ΔE3同源重組，得到去除E1基因的基因組質(zhì)粒pAd14ΔE1ΔE3-Kana；

S5.PCR擴(kuò)增Ad14 E1基因的左右臂并同向連接至卡那霉素抗性質(zhì)粒，線性化后與線性化的pAd14ΔE1ΔE3-Kana進(jìn)行重組，得到去除卡那抗性基因的基因組質(zhì)粒pAd14ΔE1ΔE3；

S6.PCR擴(kuò)增Ad14 E4基因連接至氨芐抗性質(zhì)粒得到p14E4，PCR擴(kuò)增得到Ad5基因組E4開放閱讀框2、3、4、6和6/7，取代Ad14 E4基因中相應(yīng)區(qū)域得到p14E4(5E4)，線性化后與線性化的pAd14ΔE1ΔE3同源重組，得到敲除E1、E3并改換E4的基因組質(zhì)粒pAd14ΔE1ΔE3(5E4)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S1的具體方法為：以Ad14基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到Ad14基因組左右兩端L-Ad14和R-Ad14作為重組臂連接到線性化的T載體上，得到pT-Ad14(L+R)，同時在pT-Ad14(L+R)的左右臂之間引入了EcoRI、BamHI作為酶切位點(diǎn)，EcoRI+BamHI雙酶切pT-Ad14(L+R)線性化后與Ad14基因組重組，得到pAd14。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2的具體方法為：以Ad14基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到E3基因同源重組臂L-ΔE3及R-ΔE3，反向連接至pVax載體得到pVax-ΔE3(L+R)，線性化后，與經(jīng)EcoRI部分酶切線性化的pAd14同源重組，經(jīng)氨芐青霉素、卡那霉素雙抗性篩選得到敲除E3基因同時在E3基因區(qū)引入唯一的線性化酶切位點(diǎn)swaI的質(zhì)粒pAd14ΔE3-Kana。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S3的具體方法為：以Ad14基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到E3基因同源重組臂L-ΔK(E3)及R-ΔK(E3)，正向連接至pVax載體得到pVax-ΔK(E3)，線性化后與經(jīng)SwaI線性化的pAd14ΔE3-Kana進(jìn)行重組，得到敲除E3和卡那抗性基因，同時引入Swal單酶切位點(diǎn)的pAd14ΔE3；所述步驟S4的具體方法為：根據(jù)步驟S2相同的原理，PCR擴(kuò)增得到E1基因同源重組臂L-ΔE1及R-ΔE1，反向連接至pVax載體得到pVax-ΔE1(L+R)，線性化后與PacI酶切線性化的pAd14ΔE3同源重組，經(jīng)氨芐、卡那霉素雙抗性篩選得到敲除E1基因并在E1基因區(qū)引入唯一的線性化酶切位點(diǎn)PmeI的質(zhì)粒pAd14ΔE1ΔE3-Kana。