[發(fā)明專利]一種建立快速檢測呼吸道樣本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710116930.7
• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN107058511A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 劉和錄;竇宇紅;鄒享珍;何玥;劉瓊;梁鴻
• 申請（專利權）人: 深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院;劉和錄
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12R1/22
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙)11531
• 代理人: 于鵬

【技術領域】

本發(fā)明涉及一種肺炎克雷伯菌三重qPCR方法，尤其涉及一種建立快速檢測呼吸道樣本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法。

【背景技術】

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是呼吸道感染的病原菌之一，可引起較嚴重的下呼吸道感染甚至死亡，其臨床癥狀與其他細菌感染并無兩樣，臨床難以針對該菌精準治療。近年來，由于無法早期精準治療，其耐藥問題日益突出，嚴重影響了治療效果^[1-2]。培養(yǎng)法是目前常用的檢測方法，也是金標準，一般需要2-3天，甚至更久，其時效性、簡便性、靈敏度等均無法滿足臨床快速精準診斷的需求^[3]。實時熒光定量PCR(Real Time Quantitative PCR，qPCR)通過檢測遺傳物質(DNA和/或RNA)，且快速、簡便、靈敏度高，在病原微生物檢測方面迅速發(fā)展，已成為金標準方法的重要補充^[4-6]。比如，李明等于2011年公布了主要由：正向引物：5’-GCGCGCACCTATTGTGTTG-3’、反向引物：5’–TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3’和探針：5’-CCGTCTACACCCGGGCGCC-3’組成的“肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒”應用于肺炎克雷伯菌感染的輔助診斷；2015年，江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司公布了主要由P1：5’-CCTGCATCAGACTGTCCAGTA-3’、P2：5’-CCATCTCGGTACAGTTTC-3’和Probe：5’-CAGCGTAATAACGTAGGGCGTGTAGC-3’組成的“肺炎克雷伯菌熒光PCR檢測試劑盒”用于疾病監(jiān)測、臨床診斷等領域。

然而，由于生物進化，遺傳物質既保守又變異，不同科屬細菌間有相同序列，同科屬間也有序列插入、缺失及點突變，所以細菌也象人種一樣，不同地區(qū)流行分布著不同種群或型別。這就要求設計PCR關鍵組份的引物、探針必須高度特異并適于當?shù)夭拍鼙ＷC精準診斷。

從兩項公布資料發(fā)現(xiàn)他們只檢測單基因，且均未對我國流行分布的肺炎克雷伯菌相關基因進行測序比對，僅根據NCBI或文獻資料來設計引物和探針，由于生物進化、地區(qū)分布不同等原因，可能存在靈敏度不夠或特異性不強的致命缺點。高比例的假陰性和假陽性，將給臨床帶來誤診和/或誤治等嚴重問題。

發(fā)明人用李明等的引物和探針序列在NCBI數(shù)據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)進行BLAST和模擬PCR，正、反向引物共檢索出427條序列，其中，肺炎克雷伯菌261條，除此之外還包括：大腸桿菌(Escherichia coli)、產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、泛菌屬(Pantoea)、解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultella ornithinolytica)、粘質沙雷菌(Serratia marcescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)、霍爾曼腸桿菌(Enterobacter hormaechei)、生癌腸桿菌(Enterobacter cancerogenus)、沙門氏菌(Salmonella enterica)共15屬166條序列。用反向引物和探針共檢索出428條序列，除261條肺炎克雷伯菌外，同樣包括前述15屬167條序列。由此可見，如用這些引物和探針檢測，理論上有多達16種細菌被檢測出來，其特異性非常有限，將出現(xiàn)大量假陽性。

發(fā)明人用江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司公布的引物和探針序列在NCBI數(shù)據庫進行BLAST和模擬PCR，用P1和P2、P1和探針、P2和探針均未檢索到任何序列，改用P1、P2和探針單獨BLAST，也未檢索到肺炎克雷伯菌的任何序列。顯然，由這些引物和探針組成的試劑盒將檢測不出肺炎克雷伯菌。

【發(fā)明內容】