[發明專利]用于檢測人類CYP2C19基因多態性的引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201710116322.6
• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN106755535A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 鄭仲征;安琳;芮立;尤開
• 申請（專利權）人: 上海荻碩貝肯醫學檢驗所有限公司;上海荻碩貝肯生物科技有限公司;深圳荻碩貝肯精準醫學有限公司;上海荻碩貝肯生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及用于檢測人類CYP2C19基因多態性的引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術

CYP2C19是CYP450酶第二亞家族中的重要成員，是人體重要的藥物代謝酶，臨床上大約2％的藥物都由其代謝。目前美國FDA公布將CYP2C19作為藥物基因組生物標志物的藥物共有十九種，包括氯吡格雷、S-美芬妥英、奧美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等。CYP2C19的基因多態性可導致酶活性的個體差異，使人群出現快代謝型(extensive metabolizer，EM)、中間代謝型(intermediate metabolizer，IM)和慢代謝型(poor metabolizer，PM)。CYP2C19基因的多態性位點很多，東方人攜帶的等位基因型為CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17，其中CYP2C19*17不會引起代謝活動的降低，CYP2C19*2和CYP2C19*3可引起CYP2C19基因編碼的酶活性喪失，從而導致藥物代謝能力減弱，引發不良反應。

氯吡格雷(波立維)是目前最廣泛使用的噻吩吡啶類抗血小板藥，氯吡格雷的臨床治療反應存在著顯著的個體差異，部分患者存在氯吡格雷抵抗，影響治療效果。在CYP2C亞家族中，CYP2C19亞型對藥物反應起著關鍵性的作用。2010年，美國FDA發布警告，要求在氯吡格雷包裝上附加“黑格標簽”方可出售，建議通過檢測CYP2C19的基因型從而指導氯吡格雷的使用劑量。

目前臨床應用的基因多態性檢測方法主要有四種：直接測序法，PCR-基因芯片法，PCR-溶解曲線法和熒光定量PCR法。測序法雖然為基因多態性檢測的“金標準”，但是由于其需要的檢測時間長，操作復雜，并且靈敏度不高；PCR-基因芯片法的操作要求高，雜交和洗片都必須避光操作，并且芯片價格昂貴；PCR-溶解曲線法無特異性，并不能精確定位基因變化位置，并且只是因單個堿基差異造成的Tm差異不是很明顯，通常會造成在溶解曲線上的峰不是很清晰，因而這三種方法在臨床上的推廣都存在一定困難。傳統熒光定量PCR法在臨床上應用較為廣泛，該方法對樣本數量以及多態性分布有一定要求，樣本量少時不能對樣本基因多態性進行準確檢測，對于檢測人類CYP2C19基因多態性還無法滿足高效、精準、簡便等要求，同時還需要對樣品進行基因組DNA提取等繁瑣復雜的操作流程，所以亟需一種快速、有效、精準且無需DNA提取的檢測方法。

發明內容

本發明針對現有技術中存在的上述缺陷，基于最新的科研動態和臨床應用，重新設計了用于檢測人類CYP2C19基因多態性的引物、探針以及方法。本發明的檢測方法簡便快速、精準有效、結果簡單易辨別且對于小樣本依然適用，甚至直接利用血液樣品或濾紙干血片樣品為模板進行檢測也能得到很好的結果。

為此，本發明一方面提供了一種用于檢測人類CYP2C19基因多態性的引物和探針組合，其中引物序列如序列1-4所示，探針序列如序列5-8所示，引物序列1-2以及探針序列5-6用于檢測CYP2C19*2基因的多態性，引物序列3-4以及探針序列7-8用于檢測CYP2C19*3基因的多態性。

在本發明優選的實施方案中，該引物和探針組合中，探針的5’端有FAM或VIC修飾，3’端有NFQ-MGB修飾。

在本發明進一步優選的實施方案中，該引物和探針組合中，每條引物的濃度為300nM，每條探針的濃度為200nM。

本發明基于最新的科研動態和臨床應用，重新設計了用于檢測人類CYP2C19基因多態性的引物和探針。所設計的引物Tm值均在60℃附近，整合搭配各個引物，從而盡量避免了引物二聚體的產生。同時選用MGB探針使得Tm值均在70℃附近，避免了探針與其他非特異性序列之間的結合，同時也避免了探針相互之間形成復雜的二聚體，提高了熒光PCR擴增的特異性和效率。

針對人類CYP2C19基因多態性的檢測，本發明設計的具體引物和探針情況如表1和表2所示。

表1、CYP2C19*2基因檢測的引物和探針情況表

表2、CYP2C19*3基因檢測的引物和探針情況表

本發明另一方面提供了一種用于檢測人類CYP2C19基因多態性的試劑盒，其包含本發明所述的引物和探針組合。

在本發明優選的實施方案中，本發明的試劑盒中還包含陽性對照液和空白對照液，所述陽性對照液為分別含有三種不同CYP2C19*2等位基因和兩種不同CYP2C19*3等位基因的五種細胞系DNA，所述空白對照液為TE緩沖液。