[發明專利]快速篩查P53基因外顯子5?8突變的體外檢測方法及應用

在審

• 申請號: 201710116035.5
• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN106834487A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 曾瀚;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 北京青航基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙)11498
• 代理人: 王加嶺,吉海蓮

1.一種快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)提取外周血樣品基因組DNA；

(2)設計合成用于擴增P53基因外顯子5-8的特異性引物共4對；

(3)使用上述引物對樣品基因組DNA進行高分辨率熔解曲線分析聯合觸底PCR，95℃預變性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50個循環；95℃1min，40℃1min，從65℃開始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲線，到95℃，之后40℃10s結束，用分析軟件對采集后的曲線進行分析；

(4)HRM曲線分析：如相對于陰性對照出現了單獨的峰，則為陽性結果，表明發生P53基因突變。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中的特異性引物，其核苷酸序列分別是：

P53外顯子5正向引物：如SEQ ID No.1所示；

P53外顯子5反向引物：如SEQ ID No.2所示；

P53外顯子6正向引物：如SEQ ID No.3所示；

P53外顯子6反向引物：如SEQ ID No.4所示；

P53外顯子7正向引物：如SEQ ID No.5所示；

P53外顯子7反向引物：如SEQ ID No.6所示；

P53外顯子8正向引物：如SEQ ID No.7所示；

P53外顯子8反向引物：如SEQ ID No.8所示。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中PCR的反應體系是：

總體積為15μL的反應體系包含：master mix 10μL；MgCl₂ 2.4μL；GC enhancer 0.5μL；正向引物1μL；反向引物1μL，其余為RNase free H₂O。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中向所述反應體系中加入樣品基因組DNA、陰性對照、空白對照進行觸底PCR反應。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)中外周血樣品采用干血片收集。

6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)中樣品基因組DNA的提取采用試劑盒提取。

7.權利要求1-6任一項所述的檢測方法用于快速篩查P53基因外顯子5-8突變。

8.權利要求1-6任一項所述的檢測方法在快速篩查P53基因突變檢測試劑盒中的應用。

9.一種快速篩查P53基因外顯子5-8突變的檢測試劑盒，其特征在于：包含用于擴增P53基因外顯子5-8的特異性引物共4對，其核苷酸序列分別是：

P53外顯子5正向引物：如SEQ ID No.1所示；

P53外顯子5反向引物：如SEQ ID No.2所示；

P53外顯子6正向引物：如SEQ ID No.3所示；

P53外顯子6反向引物：如SEQ ID No.4所示；

P53外顯子7正向引物：如SEQ ID No.5所示；

P53外顯子7反向引物：如SEQ ID No.6所示；

P53外顯子8正向引物：如SEQ ID No.7所示；

P53外顯子8反向引物：如SEQ ID No.8所示。

10.根據權利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于：還含有PCR試劑、陰性對照、空白對照。