[發(fā)明專利]利用二氧化碳生物轉(zhuǎn)化方法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710115621.8
• 申請(qǐng)日: 2017-03-01
• 公開（公告）號(hào): CN106916855A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴玉杰;師坤澎;胡彥營(yíng);凌君;張會(huì)圖;張秀利;賈士儒;高年發(fā);呂和鑫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P7/22
• 分類號(hào): C12P7/22;C12P7/24;C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司12207
• 代理人: 朱紅星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明為合成生物學(xué)領(lǐng)域，涉及利用CO₂生物轉(zhuǎn)化法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法。通過將羥基苯甲酸及衍生物脫羧酶基因和羧基還原酶基因構(gòu)建于同一株菌，利用得到的含有兩種功能酶的基因工程菌經(jīng)一步發(fā)酵轉(zhuǎn)化將CO₂加到酚類物質(zhì)的芳環(huán)上得相應(yīng)羧化產(chǎn)物，并進(jìn)一步將羧化產(chǎn)物還原得到相應(yīng)醛或醇。

背景技術(shù)

各種酚類及衍生物在香精、食品、藥品、化工等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，香精中許多是低分子量的酚類物質(zhì)，如香蘭素、乙基香蘭素等。由于安全原因，生物轉(zhuǎn)化法得到的這類物質(zhì)更為消費(fèi)者所接受，目前有許多關(guān)于生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香精（如香草醛）的報(bào)道。目前這些方法多是利用酚環(huán)上含有的多碳原子碳鏈進(jìn)行生物氧化斷鏈在酚環(huán)上引入羧基，再通過生物還原手段將酚環(huán)上羧基還原為醛基。如：文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的以阿魏酸，松柏醇，芳香族氨基酸，丁香酚或異丁香酚等天然化合物為底物，通過微生物轉(zhuǎn)化法生成香草醛。但這些方法都是將原料（底物）中酚的長(zhǎng)鏈側(cè)鏈氧化斷鏈后使酚環(huán)上帶有羧基，并進(jìn)一步通過微生物還原手段將羧基還原為醛基。到目前為止，尚沒有用一株菌發(fā)酵利用CO₂對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行加羧后還原制備酚類物質(zhì)衍生物的報(bào)道。

利用CO₂合成有機(jī)物及化工和醫(yī)藥中間體或香料，不僅可以充分減少碳的排放，而且從技術(shù)上避免引入其它固體或液體原料帶來的雜質(zhì)，可以縮短合成步驟，減輕分離負(fù)擔(dān)，因此從經(jīng)濟(jì)上更加合算。但采用生物轉(zhuǎn)化法對(duì)酚類物質(zhì)加羧，需要酶的催化才能完成，根據(jù)底物酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，可采用不同選擇性的羧化酶（因部分反應(yīng)可逆，有的羧化酶也叫脫羧酶），目前有水楊酸脫羧酶，4-羥基苯甲酸脫羧酶，3,4-二羥基苯甲酸脫羧酶，2,6-二羥基苯甲酸脫羧酶等，以針對(duì)不同酚類底物進(jìn)行催化加羧，可將CO₂加到酚環(huán)的不同位置，制得特定位置帶羧基的不同羥基苯甲酸衍生物。

但許多產(chǎn)品需要對(duì)上述酚羧化產(chǎn)物的羧基進(jìn)行還原得到相應(yīng)醇或醛，如香草醛的生產(chǎn)。這可采用微生物發(fā)酵或還原酶對(duì)羧基進(jìn)行還原，如采用來自諾卡氏菌的還原酶（CAR）對(duì)羧基進(jìn)行還原從而得到。但到目前為止，尚沒有利用同一株工程菌完成在酚環(huán)上加羧和將羧基還原為相應(yīng)醇或醛的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種利用CO₂生物轉(zhuǎn)化法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法，其特征在于：它是采用一株基因工程菌對(duì)苯酚及其衍生物進(jìn)行羧化，同時(shí)對(duì)羧化產(chǎn)物的羧基進(jìn)行還原生成相應(yīng)的醛或醇；

其中R₁, R₂, R₃,R₄ 分別選自H，OH，OCH₃，OC₂H₅基團(tuán)中的一種；

所述的基因工程菌指的是：羧化酶和羧基還原酶基因；

羧化酶包括：序列1對(duì)羥基苯甲酸脫羧酶基因yclBCD，序列2水楊酸脫羧酶基因sdc；

羧基還原酶包括：序列3 諾卡氏菌中的羧基還原酶基因car；序列4 土曲霉中的羧基還原酶基因ATEG03630；磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶基因；其中磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶基因指的是：序列3 枯草芽孢桿菌中的磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶的基因sfp，序列5構(gòu)巢曲霉中的磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶的基因npgA 。

本發(fā)明所述的SEQ ID NO序列1為來自枯草芽孢桿菌168的對(duì)酚類物質(zhì)起羧化作用的酶的基因yclBCD；SEQ ID NO序列2為來自酵母的水楊酸脫羧酶基因sdc；SEQ ID NO序列3來自諾卡氏菌和枯草芽孢桿菌的對(duì)羥基苯甲酸及其衍生物還原酶的基因和磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶的基因car-sfp；SEQ ID NO序列4 來自土曲霉的羧基還原酶基因ATEG03630；SEQ ID NO序列5為來自構(gòu)巢曲霉中的磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶的基因npgA。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了利用CO₂生物轉(zhuǎn)化法對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法制備的典型化合物：

4-羥基苯甲醛 ；2-羥基苯甲醛 ；

2-羥基苯甲醇；4-羥基苯甲醇；

3-甲氧基-4-羥基苯甲醛；4-羥基-3-甲氧基芐醇；

3,4-二羥基苯甲醛；3,4-二羥基苯甲醇；

3-乙氧基-4-羥基苯甲醛；3-乙氧基-4-羥基苯甲醇；