[發明專利]一種植物DNA甲基化組織特異性獲取方法

有效

• 申請號: 201710115547.X
• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN106755534B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 張德強;宋躍朋;次東
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 王加貴

1.一種植物DNA甲基化組織特異性的獲取方法，包括以下步驟：

1)提取植物組織基因組DNA；

2)在同一酶切體系中，用同裂酶和EcoRI對所述步驟1)得到的植物組織基因組DNA進行酶切，得到酶切產物，再對酶切產物連接限制性內切酶的接頭，得到連接產物；所述同裂酶為Hpa II或Msp I；

3)以所述步驟2)接頭為模板設計預擴增引物，再以所述預擴增引物對所述步驟2)得到連接產物進行PCR預擴增，得PCR預擴增產物；

4)將所述步驟3)PCR預擴增產物稀釋后，加入帶有選擇性堿基的篩選引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；

5)電泳檢測所述步驟4)得到的PCR擴增產物，統計DNA條帶，將(1,0)記為H，H代表半甲基化修飾的位點，將(0,1)記為M，M代表全甲基化修飾的位點，(0,0)和(1,1)記為N，N代表無效信息位點和非甲基化位點，對統計結果賦值，使H＝M＝1，N＝0；

6)根據所述步驟5)的賦值，利用公式1得到DNA甲基化片段的組織特異性：

公式1中，n代表分析使用植物組織的數量，i代表第i個DNA甲基化片段，j代表第j個組織，M＝1，H＝1，Ti代表第i個DNA甲基化片段的甲基化模式組織特異性值；Ti等于0代表在全部組織中發生甲基化，Ti等于1代表僅在一個組織中發生了甲基化；

利用公式2得到DNA甲基化片段組織特異性的偏好性：

公式2中，n代表分析使用植物組織的數量，i代表第i個DNA甲基化片段，j代表第j個組織，M＝1，H＝1，Bi代表第i個DNA甲基化片段的甲基化模式在組織中偏好性，Bi在[-1,0)之間代表該片段在組織中甲基化模式偏好為全甲基化模式，Bi在(0,1]之間代表該片段在組織中甲基化模式偏好為半甲基化模式，Bi＝0時代表該片段在組織中甲基化模式沒有偏好性；

所述步驟2)中的接頭包括EcoRI接頭和同裂酶接頭，所述EcoRI接頭的序列為SEQ IDNo:1或SEQ ID No:2，所述同裂酶接頭的序列為SEQ ID No:3或SEQ ID No:4；

所述步驟3)預擴增引物包括EcoRI預擴增引物和同裂酶預擴增引物，所述EcoRI預擴增引物的序列為SEQ ID No:5，所述同裂酶預擴增引物的序列為SEQ ID No:6；

所述步驟4)篩選引物包括EcoRI篩選引物和同裂酶篩選引物，所述EcoRI篩選引物序列為SEQ ID No:7～70中的一種，所述同裂酶篩選引物序列為SEQ ID No:71～134中的一種。