[發明專利]一種降解土壤中抗生素的混合菌劑及其制備方法

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• 申請號: 201710115130.3
• 申請日: 2017-02-28
• 公開（公告）號: CN106635933A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 文貽榮;黃生博
• 申請（專利權）人: 湖南省中科農業有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;B09C1/10;C12R1/125;C12R1/38
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• 代理人: 暫無信息

1.一種降解土壤中抗生素的混合菌劑，其特征在于，是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液按(0.1-3)∶1的體積比混合而成。

2.根據權利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌劑，其特征在于，是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液按0.1∶1的體積比混合而成。

3.根據權利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌劑，其特征在于，是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液按0.5∶1的體積比混合而成。

4.根據權利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌劑，其特征在于，是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液按1∶1的體積比混合而成。

5.根據權利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌劑，其特征在于，是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液按1.5∶1的體積比混合而成。

6.根據權利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌劑，其特征在于，是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液按2∶1的體積比混合而成。

7.根據權利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌劑，其特征在于，是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液按2.5∶1的體積比混合而成。

8.根據權利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌劑，其特征在于，是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液按3∶1的體積比混合而成。

9.一種如權利要求1-8中任一項所述降解土壤中抗生素的混合菌劑的制備方法，其特征在于，制備過程如下：

㈠、混懸液配制：取抗生素污染的土壤，按1：9的重量比加入到滅菌水中，攪拌成混懸液，備用；

㈡、菌落培養：

①、培養基制備：分別取NaCl 0.1g、KH₂PO₄0.05g、K₂HPO₄ 0.15g、NH₃NO₃ 0.1g、MgSO₄·7H₂O 0.01g、瓊脂1.5g，混合均勻，加蒸餾水至100ml，調節pH值至5.5～7.5，再高壓滅菌后冷卻至50℃，然后，加入土霉素，使其終質量濃度為100mg/L，即得土霉素基礎鹽固體培養基，備用；

②、培養：將混懸液用滅菌水10～120倍比稀釋，然后涂布于土霉素基礎鹽固體培養基平板上，在25～37℃下，培養1～3天，成為培養菌落，備用；

㈢、菌株分離：在經過培養的土霉素基礎鹽固體培養基平板上挑取單菌落，通過平板劃線，分離純化出細菌菌株，再經生理生化和16S rDNA測序鑒定，保留枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)J5P2和假單胞菌(Pseudomonas sp.)J2，備用；

㈣、傳代馴化：

①、馴化：將分離純化的枯草芽孢桿菌J5P2菌株和假單胞菌J2菌株，再經土霉素基礎鹽固體培養基傳代馴化，其方法是：將枯草芽孢桿菌J5P2菌株和假單胞菌J2菌株接種入質量濃度為100mg/L的土霉素基礎鹽固體培養基上，在25～37℃下培養1～3天后；再接種入質量濃度為200mg/L的土霉素基礎鹽固體培養基上，在25～37℃下培養1～3天，……，以此類推，連續傳代培養，每次使土霉素質量濃度增加100mg/L，至土霉素最終質量濃度達500mg/L，完成傳代馴化，分別成為馴化后的枯草芽孢桿菌J5P2菌株和假單胞菌J2菌株，備用；

②、LB培養基制備：分別取胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化鈉1g、瓊脂1.5g，加蒸餾水至100mL，搖動容器，直至溶質溶解,用5mol/L的NaOH調節pH值至7.0,再用去離子水定容至1L,然后在15psi高壓下蒸汽滅菌18-24min，即得LB培養基，備用；

③、保存：將馴化后的枯草芽孢桿菌J5P2菌株和假單胞菌J2菌株分別接種于LB培養基斜面，制成斜面菌種，-4℃保存，備用；

㈤、種菌液制備：在pH值5.5～7.5的條件下，取保存的枯草芽孢桿菌J5P2斜面菌種和假單胞菌J2斜面菌種，在土霉素質量濃度為100mg/L的土霉素基礎鹽培養基上活化24h～72h后，分別挑取枯草芽孢桿菌J5P2的單菌落和假單胞菌J2的單菌落接種于LB培養基中培養至對數生長期，5000r/min離心10min，收集菌體，經0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl洗滌3次，再用0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl調整菌液濃度，使其濃度為1×1010個/mL±0.5％，分別成枯草芽孢桿菌J5P2種菌液和假單胞菌J2種菌液，備用；

㈥、混合菌劑制備：將枯草芽孢桿菌J5P2種菌液和假單胞菌J2種菌液按(0.1～3)∶1的體積比混合，即成降解土壤中抗生素的混合菌劑。

10.根據權利要求9所述降解土壤中抗生素的混合菌劑的制備方法，其特征在于，制備過程如下：

㈠、混懸液配制：取抗生素污染的土壤，按1：9的重量比加入到滅菌水中，攪拌成混懸液，備用；

㈡、菌落培養：

①、培養基制備：分別取NaCl 0.1g、KH₂PO₄0.05g、K₂HPO₄ 0.15g、NH₃NO₃ 0.1g、MgSO₄·7H₂O 0.01g、瓊脂1.5g，混合均勻，加蒸餾水至100ml，調節pH值至6.5，再高壓滅菌后冷卻至50℃，然后，加入土霉素，使其終質量濃度為100mg/L，即得土霉素基礎鹽固體培養基，備用；

②、培養：將混懸液用滅菌水100倍比稀釋，然后涂布于土霉素基礎鹽固體培養基平板上，在30℃下，培養2天，成為培養菌落，備用；

㈢、菌株分離：在經過培養的土霉素基礎鹽固體培養基平板上挑取單菌落，通過平板劃線，分離純化出細菌菌株，再經生理生化和16S rDNA測序鑒定，保留枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)J5P2和假單胞菌(Pseudomonas sp.)J2，備用；

㈣、傳代馴化：

①、馴化：將分離純化的枯草芽孢桿菌J5P2菌株和假單胞菌J2菌株，再經土霉素基礎鹽固體培養基傳代馴化，其方法是：將枯草芽孢桿菌J5P2菌株和假單胞菌J2菌株接種入質量濃度為100mg/L的土霉素基礎鹽固體培養基上，在30℃下培養2天后；再接種入質量濃度為200mg/L的土霉素基礎鹽固體培養基上，在30℃下培養2天，……，以此類推，連續傳代培養，每次使土霉素質量濃度增加100mg/L，至土霉素最終質量濃度達500mg/L，完成傳代馴化，分別成為馴化后的枯草芽孢桿菌J5P2菌株和假單胞菌J2菌株，備用；

②、LB培養基制備：分別取胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化鈉1g、瓊脂1.5g，加蒸餾水至100mL，搖動容器，直至溶質溶解,用5mol/L的NaOH調節pH值至7.0,再用去離子水定容至1L,然后在15psi高壓下蒸汽滅菌21min，即得LB培養基，備用；

③、保存：將馴化后的枯草芽孢桿菌J5P2菌株和假單胞菌J2菌株分別接種于LB培養基斜面，制成斜面菌種，-4℃保存，備用；

㈤、種菌液制備：在pH值6.5的條件下，取保存的枯草芽孢桿菌J5P2斜面菌種和假單胞菌J2斜面菌種，在土霉素質量濃度為100mg/L的土霉素基礎鹽培養基上活化48h后，分別挑取枯草芽孢桿菌J5P2的單菌落和假單胞菌J2的單菌落接種于LB培養基中培養至對數生長期，5000r/min離心10min，收集菌體，經0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl洗滌3次，再用0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl調整菌液濃度，使其濃度為1×1010個/mL±0.5％，分別成枯草芽孢桿菌J5P2種菌液和假單胞菌J2種菌液，備用；

㈥、混合菌劑制備：將枯草芽孢桿菌J5P2種菌液和假單胞菌J2種菌液按(0.1～3)∶1的體積比混合，即成降解土壤中抗生素的混合菌劑。