[發(fā)明專利]用于檢測(cè)SLC2A9基因SNP位點(diǎn)rs3775948基因型的試劑盒及其檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710114801.4
• 申請(qǐng)日: 2017-02-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107058509A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 車團(tuán)結(jié);同重湘;尤崇革;謝小冬;李琳;李亞鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州百源基因技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)44288
• 代理人: 胡擁軍,趙賽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種用于檢測(cè)SLC2A9基因SNP位點(diǎn)rs3775948基因型的試劑盒及其檢測(cè)方法，能夠用于痛風(fēng)易患性風(fēng)險(xiǎn)的輔助評(píng)估。

背景技術(shù)

SLC2A9基因位于人常染色體4p15.3-16，包括12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)195kb，編碼由540個(gè)氨基酸組成的葡糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與維持體內(nèi)葡糖糖代謝的相對(duì)穩(wěn)定和平衡，也有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)該蛋白與尿酸代謝也密切相關(guān)。SLC2A9是一種高親和力、高容量、電壓敏感性和pH依賴性的尿酸鹽/己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，在腎臟主要發(fā)揮對(duì)尿酸的重吸收作用，基因功能喪失將導(dǎo)致特發(fā)性腎性低尿酸血癥。歐洲、美國(guó)、日本、非洲等多個(gè)人群的血尿酸水平與SLC2A9基因的SNP有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)漢族人群中SLC2A9 SNP rs3775948與尿酸水平顯著相關(guān)(p＝0.071)。

痛風(fēng)(Gout)和高血酸尿癥(Hyperuricemia，HUA)是人體內(nèi)嘌呤代謝紊亂引起的代謝性疾病，當(dāng)HUA患者出現(xiàn)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)內(nèi)尿酸鹽結(jié)石和痛風(fēng)性腎病將其稱之為痛風(fēng)，僅有約10％的HUA可能發(fā)展為痛風(fēng)。痛風(fēng)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，中國(guó)沿海及經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)漢族人群中痛風(fēng)發(fā)病率已達(dá)2％，而且大量流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)是高血壓、心血管疾病和腎臟疾病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，所以痛風(fēng)現(xiàn)已成為威脅人類健康的常見(jiàn)疾病之一。痛風(fēng)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，中國(guó)沿海及經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)漢族人群中痛風(fēng)發(fā)病率已達(dá)2％，其中男性的發(fā)病率約為女性的18倍，發(fā)病年齡也早于女性。痛風(fēng)作為一種復(fù)雜的多基因遺傳病，飲食和遺傳因素是其發(fā)病的主要致病因素，但其具體的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種用于檢測(cè)SLC2A9基因SNP位點(diǎn)rs3775948基因型的試劑盒及其檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法具有靈敏度高，準(zhǔn)確度高，方法簡(jiǎn)單，成本低的有點(diǎn)，有利于臨床使用和推廣。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：提供一種用于檢測(cè)SLC2A9基因SNP位點(diǎn)rs3775948基因型的試劑盒，包括以下組分：

(1)SLC2A9 rs3775948標(biāo)準(zhǔn)品；

(2)引物，包括具有SEQ ID NO.1的上游引物序列和具有SEQ ID NO.2的下游引物序列；

(3)含飽和熒光染料Eva Green的PCR擴(kuò)增試劑。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述SLC2A9 rs3775948標(biāo)準(zhǔn)品按照下述方法制備，具體包括如下步驟：

(1)重組陰性和陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-rs3775948的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化：合成具有SEQ ID NO.3的SLC2A9 rs3775948野生型DNA序列和具有SEQ ID NO.4的SLC2A9 rs3775948純合突變型DNA序列；

(2)連接反應(yīng)：將步驟(1)合成的DNA片段與pMD18-T進(jìn)行連接，采用連接體系進(jìn)行配制，配制完成后置于16℃進(jìn)行過(guò)夜連接反應(yīng)；連接體系如下：

(3)pMD18-T-rs3775948質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及PCR鑒定；

(4)pMD18-T-rs3775948質(zhì)粒的獲取和定量。

作為本發(fā)明試劑盒的優(yōu)選方案，所述步驟(3)pMD18-T-rs3775948質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及PCR鑒定具體包括如下步驟：

(3.1)從-80℃的超低溫冰箱中取出凍存的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰盒上使其解凍；

(3.2)取連接產(chǎn)物10μL加入50μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻后置冰浴30分鐘；

(3.3)42℃水浴熱激90秒，熱激后立即置冰上冷卻2min；

(3.4)于1.5ml EP管中加入預(yù)冷的1ml的不含抗性的LB液體培養(yǎng)基吹打混勻后，37℃120轉(zhuǎn)輕搖培養(yǎng)90min；

(3.5)將上述培養(yǎng)液短暫離心吸去900ul后取剩余的100ul涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿37℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜；

(3.6)從平板上挑取單克隆菌落于500μL Amp抗性LB液體培養(yǎng)基的1.5ml EP管中，37℃220rpm振蕩培養(yǎng)5-6小時(shí)；

(3.7)取1μL作為模板進(jìn)行菌液PCR鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的菌液加入到20ml的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)搖；