[發(fā)明專利]用于多重PCR的引物組合物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710114770.2
• 申請日: 2017-02-28
• 公開（公告）號: CN108517354A
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊吉元;浦浩;劉建全
• 申請（專利權(quán)）人: 上海茂槿生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6853
• 分類號: C12Q1/6853;C12Q1/6869;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 深圳舍穆專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 44398
• 代理人: 徐林茜;黃賢炬

本發(fā)明涉及一種用于多重PCR的引物組合物，該引物組合物由一對以上引物對組成，其中各引物包括5’端的形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列和3’端的特異性引物序列。本發(fā)明還涉及一種多重PCR法，包括使用上述引物組合物對DNA樣本進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，其中在PCR中采用具有雙鏈5’?3’外切活性的DNA聚合酶。采用本發(fā)明的用于多重PCR的引物組合物進(jìn)行擴(kuò)增，可以有效避免引物二聚體的形成，減少非特異性的擴(kuò)增。因而，可以在PCR擴(kuò)增中同時使用多達(dá)上百甚至上千對的引物對，并得到特異性擴(kuò)增的條帶，且擴(kuò)增覆蓋率例如達(dá)98％以上，擴(kuò)增均一性例如達(dá)到95％以上。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于多重PCR的引物組合物、包含該引物組合物的靶向測序用引物組合物、以及分別使用這兩種引物組合物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增和靶向測序的方法。

背景技術(shù)

目標(biāo)序列捕獲測序，是一種針對已知的特定基因組區(qū)域進(jìn)行測序的技術(shù)。采用目標(biāo)序列捕獲測序，例如外顯子組捕獲測序，使得研究人員能夠?qū)⒀芯恐攸c(diǎn)放在人類基因組的重要組成部分上。從而，在相同的時間和成本下，能夠研究更多的樣本，而樣本數(shù)量是發(fā)現(xiàn)致病基因的關(guān)鍵指標(biāo)，樣本量越多，定位到疾病相關(guān)基因的可能性越大。

對于一些稀有的變異或者部分體細(xì)胞的基因突變，靶向測序是一種比較有效的工具。例如，DMD基因的突變是引起杜氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良病的原因，對于該疾病的探討，非常適合采用靶向測序。

另外，對于一些遺傳疾病，其在表型上與其他疾病非常相似，有可能是由目前已知基因變異中的一種而引起的。對于這類疾病的研究，可以把可能相關(guān)的變異區(qū)域并在一起，對目標(biāo)序列進(jìn)行測序。

目標(biāo)序列捕獲測序可以分為兩種方式。一種是目標(biāo)片段的PCR目標(biāo)序列捕獲。另一種則由核酸分子堿基互補(bǔ)原理發(fā)展而來，根據(jù)目標(biāo)基因組序列設(shè)計(jì)與之完全互補(bǔ)的探針，使打斷的基因組DNA與探針雜交，從而用捕獲的DNA片段直接建庫，進(jìn)行DNA測序。

在上述的目標(biāo)序列捕獲測序方式中，使用多重PCR的目標(biāo)序列捕獲技術(shù)遇到了技術(shù)瓶頸。目前，該技術(shù)中的多重PCR一般僅能做到使用幾到幾十對引物進(jìn)行擴(kuò)增，對于更多對引物的擴(kuò)增，很難實(shí)現(xiàn)較好的效果，許多片段不能被充分?jǐn)U增。究其原因，主要在于，當(dāng)引物對數(shù)多到一定程度時，PCR引物間的相互干擾以及非特異性擴(kuò)增急劇上升，進(jìn)而會擴(kuò)增出非常多的非靶區(qū)條帶，導(dǎo)致無法有效地擴(kuò)增及分析目標(biāo)片段。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的上述狀況，本發(fā)明意在提供一種能夠有效地提升多重PCR擴(kuò)增效果的引物組合物、包含該引物組合物的靶向測序引物組合物、以及分別使用這兩種組合物進(jìn)行多重PCR和靶向測序的方法。

一方面，本發(fā)明涉及一種用于多重PCR的引物組合物，該引物組合物由一對以上引物對組成，其中各引物包括5’端的形成發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)的序列和3’端的特異性引物序列。

在一個實(shí)施方式中，各引物由5’端的形成發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)的序列和3’端的特異性引物序列構(gòu)成。

在一個實(shí)施方式中，各引物對包括正向引物和反向引物，正向引物中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列不同于反向引物中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列。

在一個實(shí)施方式中，在引物組合物中，各正向引物中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列均相同，各反向引物中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列均相同。

在一個實(shí)施方式中，各引物中形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括基本互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的15-25對堿基對，且包括由1-6個核苷酸形成的回折區(qū)。

在一個實(shí)施方式中，各引物中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列的GC含量在40-70％之間。