[發(fā)明專利]一種高通量細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710114294.4
• 申請(qǐng)日: 2017-02-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108504622A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李劍鳳;范建民;孫麗霞;王希菊;朱蕾;王桂江;張建軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 齊魯制藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/02
• 分類號(hào): C12N5/02;C12N5/071
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明涉及一種高通量細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，采用24孔培養(yǎng)板作為培養(yǎng)材料，細(xì)胞接種密度為0.2～0.5×10⁶細(xì)胞/mL，培養(yǎng)體積為0.6～1.2mL，采用搖床轉(zhuǎn)速為115～200rpm進(jìn)行搖床培養(yǎng)。本發(fā)明首次采用普通24孔板進(jìn)行震蕩培養(yǎng)達(dá)到早期的細(xì)胞株高通量篩選，不僅解決了生物藥物早期研發(fā)階段高通量篩選的問(wèn)題，而且由于大幅降低了培養(yǎng)基的使用量，在不影響篩選效果的前提下大幅降低了研發(fā)成本，縮短了研發(fā)周期，可以加快藥物的開(kāi)發(fā)速度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種24孔培養(yǎng)板高通量細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在生物藥物的上游研究階段，尤其在細(xì)胞株篩選早期，常需要進(jìn)行大量高通量篩選工作，包括細(xì)胞株篩選、培養(yǎng)基組分篩選和工藝參數(shù)優(yōu)化等，此過(guò)程是一個(gè)耗時(shí)耗力的工作，高通量篩選可以從源頭確保獲得產(chǎn)量高、質(zhì)量?jī)?yōu)的細(xì)胞株，減輕下游研究工作，加快項(xiàng)目的研究速度，提升研究質(zhì)量。

目前，早期細(xì)胞株篩選一般在孔板中靜止培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)無(wú)法真實(shí)反映出后期搖瓶懸浮培養(yǎng)的實(shí)際狀態(tài)，所以這種方法無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及表達(dá)情況，且獲得樣品量少，難以進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)量分析。搖瓶/搖管培養(yǎng)方法雖然可以真實(shí)反映出后期細(xì)胞生長(zhǎng)的真實(shí)狀況，但操作繁瑣，成本高，對(duì)搖床等硬件設(shè)施要求高，且因?yàn)橥康停贿m合早期細(xì)胞株的高通量篩選。

如中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104404082A(申請(qǐng)?zhí)?01410662495.4)公開(kāi)了一種高效的外源蛋白表達(dá)細(xì)胞株的篩選方法。包括下列步驟：目的蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；篩選藥物加壓，穩(wěn)定細(xì)胞池形成；穩(wěn)定細(xì)胞池細(xì)胞接種于半固體培養(yǎng)基中；將細(xì)胞克隆從半固體培養(yǎng)基中挑至96孔細(xì)胞板中，繼續(xù)培養(yǎng)4-5天，檢測(cè)細(xì)胞上清中目的蛋白表達(dá)量；將表達(dá)量排名前50名的細(xì)胞擴(kuò)至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)5天；將24孔板中細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)5天；將6孔板中細(xì)胞擴(kuò)至搖瓶中培養(yǎng)，檢測(cè)評(píng)估不同細(xì)胞克隆在懸浮狀態(tài)下的目的蛋白表達(dá)量；將根據(jù)搖瓶評(píng)估結(jié)果，將表達(dá)量排名前10名的細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定性傳代試驗(yàn)；根據(jù)細(xì)胞株表達(dá)目的蛋白的水平及持續(xù)表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性確立候選細(xì)胞株。該技術(shù)方案即采用靜止培養(yǎng)完成高通量篩選過(guò)程，然后對(duì)篩選后的少量目標(biāo)株再采用搖瓶培養(yǎng)篩選。

目前，高通量研究設(shè)備包括多聯(lián)微型反應(yīng)器，其通量仍相對(duì)較低，且儀器耗材等造價(jià)昂貴。因此，建立一種通量高、成本低、易操作的高通量細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，就變得非常必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種高通量細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法。本發(fā)明利用常用的24孔普通培養(yǎng)板作為材料，通過(guò)一系列培養(yǎng)條件的研究、優(yōu)化，最終建立一種高效的高通量細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，目前已用于多個(gè)項(xiàng)目細(xì)胞株篩選和培養(yǎng)基優(yōu)化，取得良好效果。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的目的之一是提供一種24孔培養(yǎng)板高通量細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，技術(shù)方案如下：

一種高通量細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，采用24孔培養(yǎng)板作為培養(yǎng)材料，細(xì)胞接種密度為0.2～0.5×10⁶細(xì)胞/mL，培養(yǎng)體積為0.6～1.2mL，采用搖床轉(zhuǎn)速為115～200rpm進(jìn)行搖床培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述培養(yǎng)體積為0.8～1.0mL，更優(yōu)選為1.0mL。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述細(xì)胞接種密度為0.3×10⁶細(xì)胞/mL。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述搖床轉(zhuǎn)速為150rpm。

根據(jù)本發(fā)明，上述技術(shù)方案可以在通常的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，比如培養(yǎng)溫度設(shè)定為36～37℃，相對(duì)濕度75％～95％，CO₂濃度5％(v/v)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的24孔培養(yǎng)板每孔容積為3.4mL。