[發(fā)明專利]癭椒樹親緣關(guān)系鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710113431.2
• 申請(qǐng)日: 2017-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN106967791B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任小龍;劉文哲;賈國倫;楊柯;辛桂亮;劉惠東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 西安恒泰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李婷

本發(fā)明公開了一種癭椒樹親緣關(guān)系鑒定的方法，對(duì)不同居群的樣本材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色拍照并記錄結(jié)果，利用獲得的[0,1]數(shù)據(jù)矩陣表用遺傳分析軟進(jìn)行分析，準(zhǔn)確的對(duì)不同種群之間進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，構(gòu)建遺傳關(guān)系樹狀圖，區(qū)分了不同的種群。同時(shí)，用此方法對(duì)不同居群不同性別間的遺傳演化關(guān)系進(jìn)行了研究，推測癭椒樹目前的雄全異株繁育系統(tǒng)由最原始兩性繁育而來。本發(fā)明反應(yīng)穩(wěn)定、擴(kuò)增片段清楚、多態(tài)性高，能準(zhǔn)確快速對(duì)癭椒樹不同種群間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行分析，能快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行聚類分析，區(qū)分不同種群。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于苗木育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種苗木育種的檢測方法，具體涉及一種癭椒樹親緣關(guān)系鑒定的方法。

背景技術(shù)

癭椒樹(Tapiscia sinensis Oliv)屬于癭椒樹科，是一種多年生落葉喬木，種群中雄株和兩性株異株(雄全異株)，雄株不結(jié)果，兩性植株6月初完成受精,受精后果實(shí)進(jìn)入休眠狀態(tài)直至第二年三月才開始發(fā)育，其自然種群中兩性花可以產(chǎn)生可育花粉。癭椒樹為我國特有的古老的第三紀(jì)古熱帶孑遺樹種，國家三級(jí)保護(hù)植物。其作為一種古老瀕危樹種，在研究生物進(jìn)化，植物繁育系統(tǒng)演化，性別決定機(jī)制方面具有重要理論意義。

SRAP(Sequence-Related Amplfied Polymorphism，序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性)DNA分子標(biāo)記技術(shù)是美國加州大學(xué)Li與Quiros于2001年中開發(fā)出來的一種新型的基于PCR的雙引物分子標(biāo)記技術(shù)。其利用正向引物的CCGG與外顯子區(qū)域結(jié)合而反向引物的AATT與內(nèi)含子區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的特點(diǎn)對(duì)基因保守的ORF(open reading frame，開放閱讀框)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果與表型/基因型具有密切相關(guān)性，同時(shí)因?yàn)槠渚哂泻芨叩牟僮骱喴仔院蛿U(kuò)增多態(tài)性，SRAP標(biāo)記在物種種群遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系分析中得到了廣泛的應(yīng)用。目前已經(jīng)成功應(yīng)用于甘藍(lán)，西葫蘆，野牛草，棉花，荔枝等作物遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建，遺傳親緣關(guān)系分析等方面。

癭椒樹傳統(tǒng)的育苗方式主要兩種類型,即有性繁殖和無性繁殖,有性繁殖以種子繁殖為主。在苗木育種親本選配中，傳統(tǒng)方法依靠育種學(xué)家的田野形態(tài)鑒定手段，這在很大程度上限制了新品種選育的準(zhǔn)確性和可靠性，分子標(biāo)記的手段則有助于在育種之前提前理清育種材料之間的親緣關(guān)系，大大節(jié)省了育種周期，節(jié)省了育種成本，提高了可靠性。在癭椒樹中利用SRAP分子標(biāo)記方法進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定和遺傳多樣性分析尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在問題，本發(fā)明的目的在于提供一種癭椒樹親緣關(guān)系鑒定方法，該方法操作簡單，周期短，成本低效率高，對(duì)于癭椒樹育種中親本選配具有重要指導(dǎo)價(jià)值。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn),包括如下步驟：

一種癭椒樹親緣關(guān)系鑒定方法，包括以下步驟，

(1)提取不同居群癭椒樹基因組DNA，構(gòu)建總DNA池、雄性DNA池和兩性DNA池；

(2)分別以總DNA池、雄性DNA池和兩性DNA池為模板進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳及銀染顯色后得到多條多態(tài)性條帶；

以總DNA池為模板時(shí)，采用的引物共10對(duì)，包括SEQ ID NO.1～NO.20；以雄性DNA池為模板或以兩性DNA池為模板時(shí)，采用的引物共10對(duì)，包括SEQID NO.21-NO.40；

(3)根據(jù)所述多條多態(tài)性條帶得到不同居群不同性別癭椒樹的DNA指紋圖譜；

(4)根據(jù)DNA指紋圖譜表分別得到不同居群和不同性別的癭椒樹親緣關(guān)系樹狀圖。

步驟(1)中提取基因組DNA是通過癭椒樹幼嫩葉片提取；構(gòu)建DNA池具體步驟包括：將每個(gè)居群癭椒樹雄性基因組DNA和兩性基因組DNA等重量混合構(gòu)建對(duì)應(yīng)居群總DNA池，每個(gè)居群癭椒樹雄性基因組DNA構(gòu)成對(duì)應(yīng)居群雄性DNA池，每個(gè)居群癭椒樹兩性基因組DNA構(gòu)成對(duì)應(yīng)居群兩性DNA池。