[發(fā)明專利]一種檢測(cè)JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型的試劑盒及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710113052.3
• 申請(qǐng)日: 2017-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN106868136A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 車團(tuán)結(jié);同重湘;尤崇革;謝小冬;李琳;李亞鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州百源基因技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)44288
• 代理人: 胡擁軍,趙賽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型的檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

JAG2基因是NOTCH信號(hào)通路的配體之一，它的主要作用是參與了次級(jí)腭的形成和發(fā)育過(guò)程，被認(rèn)為是唇腭裂的候選基因之一。JAG2基因rs741859(c*1053G>A)位點(diǎn)位于該基因的5’端附近，在研究中該位點(diǎn)AG、GG基因型表現(xiàn)出與非綜合征性唇腭裂有顯著性相關(guān)性。

作為常見(jiàn)的出生缺陷和顱面發(fā)育缺陷，唇腭裂是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，國(guó)際上將其分為綜合征性(syndromic cleft lip or palate，SCLP)和非綜合征性唇腭裂(non-syndromic cleft lip or palate，NSCLP)。全球唇腭裂的發(fā)生率為3-22/10000，而我國(guó)的發(fā)生率約為1.82/1000。NSCLP的發(fā)病原因有很多，其中遺傳和環(huán)境的影響占據(jù)了主要作用。研究發(fā)現(xiàn)許多信號(hào)通路參與了唇腭的發(fā)育，不同染色體區(qū)間在唇腭裂發(fā)病中具有一定作用。目前已知的NSCLP易感區(qū)有Iq32，2p，2q，3q27-28，4q，6p23-p25，8q24，9q21，12p11，14q21-24,16q24和19q13，可能的易感基因有IRF6、SATB2、TP63、FQXE1、PVRL1、MSX1、GABRB3，CRISPLD2，MAFB和ABCA4等。

高分辨率熔解曲線(high resolution melting,HRM)的分析原理是在常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過(guò)程中飽和熒光染枓與雙鏈DNA結(jié)合，當(dāng)通過(guò)加熱升溫使DNA雙鏈解離時(shí)，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，由于突變、SNP位點(diǎn)雙鏈堿基間不匹配會(huì)使雙鏈DNA在此位點(diǎn)首先解開，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中的熒光強(qiáng)度，從熒光強(qiáng)度與時(shí)間軸曲線上便可判斷是否存在突變或SNP，而且不同位點(diǎn)、雜合子與否、GC含量、擴(kuò)增子長(zhǎng)度等都會(huì)影響熔解曲線的峰形。所以，HRM分析能夠有效區(qū)分不同突變位點(diǎn)、SNP位點(diǎn)和擁有不同GC含量的擴(kuò)增片段。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型的試劑盒。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是為了提供一種上述試劑盒的制備方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過(guò)采取如下技術(shù)方案達(dá)到：

一種檢測(cè)JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型的試劑盒，包括：標(biāo)準(zhǔn)品、引物、含有熒光染料的qPCR擴(kuò)增試劑；所述標(biāo)準(zhǔn)品為包含JAG2rs741859(c*1053G>A)位點(diǎn)的野生型DNA序列和包含JAG2rs741859(c*1053G>A)位點(diǎn)的純合突變型DNA序列；所述引物用于擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測(cè)樣品。

優(yōu)選地，所述野生型DNA序列為序列W；所述純合突變型DNA序列為序列M。

優(yōu)選地，所述標(biāo)準(zhǔn)品為連接有序列W的質(zhì)粒和連接有序列M的質(zhì)粒。

優(yōu)選地，所述引物為JAG2-F和JAG2-R。

優(yōu)選地，所述含有熒光染料的qPCR擴(kuò)增試劑為生工生物工程(上海)股份有限公司所產(chǎn)的含EvaGreen的Green-2-Go qPCR Mastermix試劑盒。

本發(fā)明還提供所述的檢測(cè)JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型的試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

1)引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)JAG2rs741859基因序列，應(yīng)用Primer express 3軟件、PrimerPremier 5軟件以及Oligo 7軟件，設(shè)計(jì)一組引物；

2)制備標(biāo)準(zhǔn)品

A、合成含有JAG2rs741859(c*1053G>A)位點(diǎn)的野生型DNA序列和純合突變型DNA序列；

B、將野生型DNA序列和純合突變型DNA序列分別與質(zhì)粒連接；將連接后的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中；培養(yǎng)細(xì)菌并且獲得陽(yáng)性克隆；

C、擴(kuò)大培養(yǎng)步驟B所獲得的陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒得到標(biāo)準(zhǔn)品；

3)選購(gòu)或配制含有熒光染料的qPCR擴(kuò)增試劑。

優(yōu)選地，步驟B中所述的質(zhì)粒為pMD18-T質(zhì)粒。

優(yōu)選地，所述野生型DNA序列為序列W；所述純合突變型DNA序列為序列M。

優(yōu)選地，步驟B中將序列W或序列M分別與pMD18-T質(zhì)粒連接，所采用的連接體系為：

SolutionI為來(lái)自TaKaRa公司，編號(hào)D6020A的產(chǎn)品。

連接的反應(yīng)時(shí)間為10-16小時(shí)，反應(yīng)溫度為16℃。