[發明專利]一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710112929.7
• 申請日: 2017-02-28
• 公開（公告）號: CN106890327A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 柳紀省;李寶玉;高鵬;李守湖;高欣;吳鵬程;范玉峰
• 申請（專利權）人: 蘭州威特森生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/205
• 分類號: A61K39/205;A61P31/14;C12N15/861
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司11249
• 代理人: 姜司晨

1.一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，其特征在于，將傳染性造血器官壞死癥病毒抗原蛋白G基因插入到復制缺陷型腺病毒穿梭載體的特異性啟動子和終止子之間，構建得到含有G基因的重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體，再將重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體與腺病毒骨架載體通過同源重組得到重組腺病毒質粒，用重組腺病毒質粒產生基因組結構均一的重組腺病毒，即得到防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗。

2.根據權利要求1所述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，其特征在于，所述傳染性造血器官壞死癥病毒抗原蛋白G基因是通過PCR方法擴增出的，擴增引物序列分別為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

3.根據權利要求1所述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，其特征在于，所述重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體的構建過程中，腺病毒載體啟動子為CMV，終止子為PolyA；

構建過程具體包括以下步驟：

1）將擴增得到的目的基因G經BglⅡ、SalⅠ雙酶切，形成帶有粘性末端的目的基因片段；

2）同時，將腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV經BglⅡ、SalⅠ雙酶切，得到線性化的載體；

3）使用T4 DNA連接酶對步驟1）和2）的產物進行粘端連接；

4）按常規方法將連接產物轉化大腸埃希氏菌，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質粒；

5）采用酶切、PCR擴增方法鑒定，得到陽性重組質粒，命名為PAdTrack-CMV/G。

4.根據權利要求1所述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，其特征在于，重組腺病毒質粒的獲得包括以下步驟：

1）將重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV/G用Pme I單酶切以線性化；

2）取PAdEasy-1與步驟1）得到的線性化后的重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體混合，高壓電轉化大腸桿菌BJ5183；

3）電轉后將細胞在培養液中復蘇，取細胞涂入含卡那霉素的培養板中，培養；

4）挑選卡那霉素抗性克隆，小量提取質粒DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳遷移率分析，并進行限制性內切酶圖譜分析；

5）將所得的重組腺病毒質粒高壓電轉化入宿主菌，從此宿主菌中獲得的大量高質量質粒中挑選目的克隆，所述宿主菌為DH10B。

5.根據權利要求1所述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，其特征在于，重組腺病毒質粒產生基因組結構均一的重組腺病毒，包括以下步驟：

1）將重組腺病毒質粒，用Pac I酶切，完全消化以切去包括Ori和Kan抗性基因在內的質粒構件，并暴露其反轉末端重復序列；

2）脂質體介導的轉染，在組織培養皿中接種293細胞進行轉染；

3）取病毒上清接種293細胞，以含2%小牛血清的完全DMEM培養液于培養箱中培養，逐日觀察細胞病變，至293細胞完全病變；

4）收集病毒感染的病變細胞，檢測抗原蛋白G基因的表達，再連同上清液凍存。

6.根據權利要求5所述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟2）中脂質體介導的轉染，包括以下步驟：

a）稀釋Pac I酶切線性化的重組腺病毒質粒至DMEM培養液中；

b）再將脂質體懸液加至DMEM培養液中，充分將二者混勻，室溫下溫育；

c）在此期間吸棄細胞原培養液，用DMEM培養液洗細胞一次；

d）往每平皿中加DNA/脂質體復合物，在5%CO₂培養箱中溫育后吸棄含DNA/脂質體復合物的培養液；

e）補加含10%小牛血清的DMEM完全培養液，繼續培養，脂質體轉染后收集細胞，反復凍融。

7.根據權利要求1-6所述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法制備得到的含有抗原蛋白G基因的傳染性造血器官壞死癥病毒活載體疫苗。

8.根據權利要求7所述的含有抗原蛋白G基因的傳染性造血器官壞死癥病毒活載體疫苗在制備預防或治療虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的藥物中的用途。