[發明專利]攜帶融合蛋白基因的重組腺病毒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710112172.1
• 申請日: 2010-02-11
• 公開（公告）號: CN107058231A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 劉書遜;曹雪濤;江金霞;劉娟;韓超峰
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N7/01;A61K39/00;A61P35/00;C12R1/93
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司31100
• 代理人: 余穎

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及一種人癌胚抗原576-669(CEA_576-669)和熱休克蛋白70樣分子1(hsp70L1)融合基因的重組腺病毒及其制備方法和應用。

背景技術

熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一類在生物進化中高度保守、廣泛存在于原核及真核生物中的一類蛋白質，在細胞受到應激后表達增加。HSP在細胞內作為伴侶分子，參與抗原的加工和形成MHC-抗原肽復合物。

近年來，HSP家族明顯的佐劑樣作用引起了國內外學術界的關注。研究表明，HSP在細胞受到應激后，可以釋放到細胞外，誘導抗原提呈細胞和T細胞成熟活化等重要的生理過程，因此與機體的抗腫瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫性疾病等生理及病理機制密切相關，是一類重要的免疫分子(Srivastava PK,Annu Rev Immunol.2002；20:395–425)。

熱休克蛋白家族按照分子量可以分為四類：Hsp90家族、Hsp70家族、HSP60家族和小分子Hsp家族，其中Hsp70家族是HSP中最保守和最主要的一類。許多研究表明，腫瘤細胞或者病毒感染細胞來源的Hsp70-肽復合物、Hsp70分子聯合多肽抗原、或者與多肽抗原交聯的復合物，能夠明顯誘導產生抗原特異性的CD8⁺的CTL，單獨使用Hsp70或者單獨應用多肽抗原則無此效應，因此HSP在抗原遞呈過程中的佐劑樣作用及小分子肽的免疫原性是HSP介導的免疫治療所不可缺少的兩個重要部分(Todryk SM等,Immunology.2003；110:1-9；Manjili MH等,Expert Opin Biol Ther.2004；4:363-373；Blachere NE等,J Immunother Emphasis Tumor Immunol.1993；14:352-356；Li Z等,Behring Inst Mitt.1994；94:37-47；Moroi Y等,Proc Natl Acad Sci USA.2000；97:3485–90)。

HSP誘導的特異性CTL反應是由于專職抗原遞呈細胞(APC)上存在HSP的受體，可以使APC特異性地通過HSP受體介導抗原肽的內吞(Arnold-Schild D等,J Immunol.1999；162:3757-3760)；HSP結合的抗原在胞內是通過TAP依賴及TAP非依賴途徑，被遞呈到MHC-I類分子上，并誘導隨后的CTL反應，這種受體被證明存在于DC、巨噬細胞及B細胞等APC上，而不存在于T細胞上(Castellino F,J Exp Med.2000；191:1957-1964)；因此可以認為，HSP通過HSP受體與APC相互作用是HSP作為佐劑的一個重要機理。研究表明，這種受體介導的抗原遞呈方式的效率比吞噬高10000倍。

HSP70分子在胞外可以行使類似細胞因子樣作用。HSP70可與單核細胞產生高親和力的結合，誘導其產生IL-6、IL-1等活性細胞因子，并可以誘導DC成熟，上調其MHC-II和CD86分子表達，分泌IL-12和TNF-α，從而增強DC的抗原遞呈能力(Svensson PA等；Atherosclerosis.2006；185:32-38)。因此，采用HSP作為免疫佐劑協同腫瘤抗原誘導DC，可以靶向性介導抗原的遞呈，增強抗原的遞呈效率，從而誘導更強的CTL反應。

在明確了HSP的獨特佐劑效應的基礎上，利用HSP的佐劑作用誘導抗腫瘤和抗感染免疫因此成為熱點，基于HSP的新一代疫苗紛紛進入臨床試驗研究。基于HSP的疫苗構成概括起來主要有以下幾種方式：1、從腫瘤細胞或病毒感染細胞純化HSP-肽復合物，用純化的HSP-肽復合物體內免疫激發抗腫瘤或抗感染免疫。HSP肽復合物用于腫瘤治療具有明顯的優勢，因為提取的HSP肽復合物可以直接用于免疫治療，不需要鑒定其中所包含的腫瘤特異性抗原表位。不足的是，此方案多采用個體化治療方案，即免疫所用的HSP-肽復合物需要來源于自體腫瘤細胞。2、通過原核和真核表達得到HSP，通過體外交聯使合成的表位肽結合于HSP肽結合袋，再用交聯的HSP-肽復合物誘導抗腫瘤或抗感染免疫。3、HSP抗原的融合蛋白免疫。4、HSP抗原基因融合表達的DNA疫苗或腺病毒疫苗。