[發明專利]一種包含蝙蝠肝炎病毒核心蛋白的重組融合蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710111914.9
• 申請日: 2017-02-28
• 公開（公告）號: CN106986942B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 李啟明;梁宇;張靖;楊森森;王擎擎;邵帥;陳實;靳玉琴;張學峰;馬智靜;郭舒楊;雷澤華;吳海嵐
• 申請（專利權）人: 國藥中生生物技術研究院有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/81;C12N7/04;C07K16/10;C12N1/19;A61K39/155;A61P31/14;C12R1/78;C12R1/93
• 代理公司: 北京東巖躍揚知識產權代理事務所(普通合伙) 11559
• 代理人: 谷岳

本發明提供了一種包含蝙蝠肝炎病毒核心蛋白的重組融合蛋白，所述重組融合蛋白由蝙蝠肝炎病毒核心蛋白和插入在所述蝙蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸之間的外源蛋白質片段組成，所述蝙蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明首次利用蝙蝠肝炎病毒核心蛋白作為外源表位呈遞載體，通過優化設計，重組融合蛋白在漢遜酵母中表達形成嵌合病毒樣顆粒，該嵌合病毒樣顆粒作為疫苗成分，在保證疫苗安全性的前提下，可刺激產生較強的免疫應答，用于預防RSV的感染，具有重要的科學和應用價值。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，特別涉及一種包含蝙蝠肝炎病毒核心蛋白的重組融合蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus(RSV))是世界范圍內引起嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原體。出生后兩年內90％以上嬰幼兒至少經歷一次RSV感染，6個月以下嬰兒、老年人及免疫缺陷人群易發生嚴重感染及死亡。對于RSV感染引起的疾病，目前唯一有效的上市藥物就是帕利珠單抗(Palivizumab)。RSV屬于副粘病毒科，肺炎病毒屬，是非節段單股負鏈RNA囊膜病毒。病毒基因組全長15.2kb，包含10個編碼基因(依次為NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2、L)，共編碼11種蛋白，包括3種核衣殼蛋白(N、P、L)、3種跨膜蛋白(F、G、SH)、3種基質蛋白(M、M2-1、M2-2)和2種非結構蛋白(NS1、NS2)。其中G、F兩種糖蛋白又被稱為粘附蛋白和融合蛋白，分別介導病毒與細胞的黏附和融合，對于病毒侵染宿主細胞具有重要作用，這兩種蛋白也是目前疫苗研制的主要靶抗原。根據G蛋白抗原特異性可將RSV分為A和B兩個亞型，兩型間G蛋白氨基酸序列僅有53％同源性，而F蛋白則有較高氨基酸同源性，高達90％，且以F蛋白作為疫苗抗原可同時預防A和B兩個亞型的RSV感染。

F蛋白由F1、F2兩個亞基組成，為I型糖蛋白，以三聚體形式存在。F蛋白存在兩種狀態：亞穩定的融合前與較穩定的融合后狀態。目前已發現F蛋白有6個中和抗體表位：I、II、IV、V和VI及融合前抗原位點針對抗原位點I、II、IV均有相應中和單抗研制的報道，其中抗原位點II就是RSV預防及治療性單抗帕利珠(Palivizumab)及莫維珠(Motavizumab)的結合位點，位于F1亞基的255-278位氨基酸，是“α螺旋-環-α螺旋”二級結構的構象型表位，在F蛋白融合前后構象狀態保持不變，因此帕利珠對于融合前和融合后的RSV均具有中和活性。

上世紀60年代經甲醛滅活的RSV疫苗(FI-RSV)在臨床試驗中出現了嚴重的ERD現象，免疫后的嬰幼兒再次感染RSV時不但沒起到預防作用，肺部炎癥反應反而加重，最終造成2名嬰幼兒死亡。因此在RSV疫苗研發中如何規避ERD現象并提高疫苗的安全性和有效性成為首要考慮問題。目前已有較多的RSV候選疫苗包括減毒活疫苗、重組活病毒疫苗、重組亞單位(G/F蛋白)疫苗和核酸(G/F)疫苗等都處于臨床前和臨床研究。以Novavax公司、Medimmune公司和GSK公司為代表的研發機構均以RSV F蛋白作為疫苗的靶抗原，且進入臨床研究階段，臨床研究數據顯示在成人中對于控制和預防RSV感染具有明顯作用。

雖然F蛋白有很好的免疫原性，但純化后的F蛋白免疫棉鼠后進行攻毒試驗曾經出現過ERD現象，揭示F蛋白仍存在一定程度的安全風險。同時，不僅由F蛋白制備的疫苗可能會出現ERD現象，其他免疫原蛋白同樣會有類似的風險。因此，尋找一種安全有效的針對呼吸道合胞病毒的疫苗極為重要。

發明內容

本發明要解決的技術問題是針對現有技術中的疫苗免疫應答弱，并且存在安全隱患的問題，提供了一種包含蝙蝠肝炎病毒核心蛋白的重組融合蛋白及其制備方法和應用。

為了解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為：

一種包含蝙蝠肝炎病毒核心蛋白的重組融合蛋白，所述重組融合蛋白由蝙蝠肝炎病毒核心蛋白和插入在所述蝙蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸之間的外源蛋白質片段組成，所述蝙蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。