[發明專利]一種子宮內膜干細胞的提取及其構建干細胞庫的方法

在審

• 申請號: 201710109658.X
• 申請日: 2017-02-27
• 公開（公告）號: CN106834219A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 汪娟
• 申請（專利權）人: 蘭赫（上海）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種子宮內膜干細胞的提取及其構建干細胞庫的方法。

背景技術

干細胞(Stemcell，SC)是一種未分化細胞，這些細胞保持著高度增殖、自我更新和分化潛能的特性。干細胞可以定向分化為血液、骨骼、大腦及皮膚等其他組織。可能作為修復系統修復受損細胞。干細胞又可分為胚胎干細胞，臍血干細胞，成體干細胞及生殖干細胞等類型。干細胞在成體組織中調控成體細胞增殖、分化、凋亡及保持細胞數目的平衡中起到十分重要的作用。

人的子宮內膜是一個高度再生組織，在育齡期婦女中要經歷400多次的增殖、分化和脫落。人子宮內膜由腺上皮細胞、間質細胞和血管組成，近年越來越多的研究表明，子宮內膜組織中存在一小群具有強大增殖和多向分化潛能的干細胞，可不斷分裂增殖，及時補充脫落的終末分化細胞，使子宮內膜始終保持自我更新和再生能力。在月經周期的不同時期，內膜上皮和間質細胞的集落形成活性無明顯差別。進一步的研究發現，內膜間質細胞在增生期的集落形成能力超過分泌期，而上皮細胞在分泌期的集落形成能力更強。因此可以推斷，子宮內膜上皮和基質細胞具有子宮內膜干細胞的特性，在子宮內膜周期性脫落，增長中起到關鍵作用。現代婦產科學研究向細胞、亞細胞及分子水平發展，在體外成功的培養子宮內膜干細胞可為研究細胞的生長分化、代謝以及激素作用機制提供一個理想的實驗模型。

由于子宮內膜組織中干細胞存量較少，因此，本領域技術人員致力于開發高效地子宮內膜干細胞提取方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種子宮內膜干細胞的提取及其構建干細胞庫的方法。

本發明的第一方面提供了一種子宮內膜干細胞的提取方法，所述方法包括步驟：

1)預處理

在無菌條件下，對獲得的子宮內膜組織材料，進行剪碎處理放入冰浴DMEM/F12培養基中；

2)消化

加入約1-4倍體積的消化液，消化液中含膠原酶I(50U/ml)和膠原酶IV(50U/ml)，37℃消化30-90min，獲得單細胞懸液；將消化好的單細胞懸液移入離心管，靜置幾分鐘去除剩余的大塊組織；離心后，基質細胞和上皮細胞存于上清液中；

3)原代培養

將步驟2)分離的細胞懸液接種于培養瓶中，培養基為DMEM/F12培養基，含5-20％(v/v)胎牛血清、1％(w/v)青/鏈霉素，37℃、5％C0₂培養箱孵育，即獲得所述子宮內膜干細胞。

進一步地，步驟1)中，將子宮內膜組織材料剪碎至0.5-2mm³。

進一步地，步驟2)中，加入約2-3倍體積的消化液。

進一步地，步驟2)中，所述消化液中還包括亞硫酸氫鈉。

優選地，所述亞硫酸氫鈉的濃度為5-20mg/ml，更優選為10mg/ml。

進一步地，步驟2)中，37℃消化50-60min。

進一步地，步驟2)中，離心條件為1000-1800rpm離心2-5min。

進一步地，步驟2)中，離心條件為1500rpm離心3min。

進一步地，步驟2)中，加入約2-3倍體積的消化液。

進一步地，步驟3)中，細胞接種密度為3×10⁴-3×10⁵個/ml。

進一步地，步驟3)中，細胞接種密度為2×10⁵個/ml。

進一步地，步驟3)中，培養基為DMEM/F12培養基，含10％(v/v)胎牛血清。

本發明的第二方面提供了一種構建子宮內膜干細胞庫的方法，所述方法包括步驟:

a)根據本發明第一方面的方法提供子宮內膜干細胞；

b)對步驟a)中獲得的子宮內膜干細胞進行傳代培養。

使用本發明提供的子宮內膜干細胞的提取方法，獲得的子宮內膜干細胞存活率高而且在培養過程中具有較高的增殖能力

應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1為P8子宮內膜干細胞的顯微照片。

圖2顯示了Nestin染色情況。

具體實施方式