[發(fā)明專(zhuān)利]一種高效的黑木耳原生質(zhì)體制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710109350.5
• 申請(qǐng)日: 2017-02-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107058121A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚方杰;劉宏宇;方明;張友民;陸甲;張偉彤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/14
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司22100
• 代理人: 魏征驥

1.一種高效的黑木耳原生質(zhì)體制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）制作固體PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g煮汁后使用16層紗布過(guò)濾取汁，20g葡萄糖，20g瓊脂粉，蒸餾水定容1L，使用121℃，0.1Mpa高壓滅菌后，在無(wú)菌環(huán)境中每15mL倒入一個(gè)培養(yǎng)皿中，待其冷卻凝固后，用封口膜封口備用；

（2）將黑木耳菌種在超凈工作臺(tái)中取0.5cm×0.5cm大小菌塊放置于PDA固體培養(yǎng)基上，用封口膜密封后，放入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d；

（3）制備液體加富菌絲培養(yǎng)基：馬鈴薯200g煮汁過(guò)濾，加入葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸粉2g，磷酸二氫鉀 3g，七水合硫酸鎂2g，蒸餾水定容950mL，使用121℃，0.1Mpa高壓滅菌，將10g甘氨酸用蒸餾水配置成甘氨酸溶液，在無(wú)菌環(huán)境下使用注射器通過(guò)0.22μm微孔濾膜將甘氨酸溶液過(guò)濾滅菌后，加入高壓滅菌后的液體培養(yǎng)基中，定容為1L；

（4）在無(wú)菌環(huán)境中向長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲的固體PDA培養(yǎng)皿中倒入10mL，刮取固體PDA培養(yǎng)基表面的菌絲，使用移液器將帶有菌絲的液體培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿中接入到50mL的液體培養(yǎng)基中，在25℃的恒溫?fù)u床中120rpm培養(yǎng)7d；

（5）高滲溶液及酶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取109.3g的甘露醇，用0.1mol/L的pH為5.8的磷酸緩沖液定容1L，使用115℃高壓滅菌15min，冷卻至室溫后即是高滲緩沖液，稱(chēng)取購(gòu)買(mǎi)自廣東省微生物菌種保藏中心的lywallzyme溶壁酶0.4g，溶解于2mL甘露醇緩沖液后，無(wú)菌環(huán)境下使用注射器通過(guò)0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾滅菌后即配制為2%的酶液；

（6）使用6層無(wú)菌的紗布將在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d的菌絲進(jìn)行過(guò)濾，棄去濾液，收集紗布上的菌絲，使用無(wú)菌濾紙吸干菌絲中的培養(yǎng)基，將收集的菌絲放入2mL的離心管中，使用離心機(jī)3000rpm離心3min，棄去上清保留沉淀，取0.75g的菌絲放入離心管中，按照菌絲：酶液=1:2（m:V）加入1.5mL的酶液，使用無(wú)菌研磨棒研磨五次后，漩渦混勻3min，使菌絲離散均勻，在30℃的氣浴恒溫?fù)u床中，70rpm震蕩酶解2h后，使用填裝厚度為0.5mm脫脂棉的注射器過(guò)濾，將濾液3000rpm離心10min，棄去上清，加入0.6mol/L的甘露醇高滲溶液1mL，再次離心，棄去上清，加入0.6mol/L的甘露醇高滲溶液0.5mL，3000rpm離心10min，加入0.6mol/L的甘露醇高滲溶液0.5mL，輕柔的顛倒10-15次以重懸原生質(zhì)體后，在顯微鏡下，使用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量并計(jì)算原生質(zhì)體數(shù)目。