[發(fā)明專利]一種苦瓜單粒種子DNA快速提取方法

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• 申請日: 2017-02-27
• 公開（公告）號: CN106834276A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮誠誠;黃如葵;陳小鳳;梁家作;陳振東;黃熊娟;黃玉輝;秦建;劉杏連
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京中譽(yù)威圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11279
• 代理人: 朱志寬

1.一種苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)取苦瓜種子1粒，去掉種皮后，用滅菌的刀片將其剖成4半，裝入2mL圓頭離心管，離心管內(nèi)置兩顆2mm直徑鋼珠，液氮速凍45s，采用高通量組織研磨器研磨破碎，參數(shù)設(shè)定頻率為75Hz、速率1500rpm，時(shí)間為90s；

(2)加入1.5mL試劑A，混勻后，置于65℃水浴鍋中水浴45-60min，水浴期間每隔5min將離心管上下顛倒混勻1次；

(3)水浴后，用離心機(jī)離心10min；

(4)取上清，加入等體積的試劑B，上下顛倒混勻3-5min，離心管加入苯酚后要?jiǎng)×翌嵉箵u勻50次以上，然后用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速12000r/min下離心10min；

(5)按照上述步驟(4)重復(fù)操作1次；

(6)離心后，取上清，加入等體積試劑C進(jìn)行抽提，輕輕搖晃15-20min，然后用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速12000r/min離心10min；

(7)按照上述步驟(6)重復(fù)操作1次；

(8)離心后，移液器輕輕地吸取上清夜至1.5mL離心管中，加入等體積預(yù)冷的試劑D，離心管慢慢上下?lián)u動30s，使試劑D與水層充分混合至能見到DNA絮狀物，于4℃下沉淀30min；

(9)待沉淀結(jié)束后，用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10min，棄上清，用無水乙醇清洗，在通風(fēng)廚里晾干，用1×TE溶解，同時(shí)加入1.5μL RNA酶，再將其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜單粒種子DNA；

(10)將得到的苦瓜單粒種子DNA置于-20℃下保存，備用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，其特征在于，步驟(1)中苦瓜的品種為桂農(nóng)科3號、桂農(nóng)科6號或翠竹。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，其特征在于，步驟(1)中所述的高通量組織研磨器的參數(shù)設(shè)定為：頻率為75Hz、速率1500rpm，時(shí)間為90s。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述的試劑A在使用前提前預(yù)熱至65℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述的試劑A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，質(zhì)量濃度2％的CTAB、質(zhì)量濃度1％的PVP-40和質(zhì)量濃度0.5％的β-巰基乙醇，其余為蒸餾水；pH 8.0。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為12000r/min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，其特征在于，步驟(4)中所述的試劑B包括：Tris-HCl平衡苯酚與等體積的氯仿/異戊醇(24：1)混合均勻，棕色瓶4℃保存。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，其特征在于，步驟(6)中所述的試劑C包括：將氯仿和異戊醇按照體積比24：1混合均勻，棕色瓶4℃保存。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦瓜單粒種子DNA快速提取方法，其特征在于，步驟(8)中所述的試劑D包括異丙醇和醋酸鈉，二者的體積質(zhì)量比為10:1。