[發明專利]基于高通量測序的PCR產物大樣本量混合建庫的文庫構建方法和試劑有效
| 申請號： | 201710107944.2 | 申請日： | 2017-02-27 |
| 公開（公告）號： | CN108504651B | 公開（公告）日： | 2020-09-08 |
| 發明（設計）人： | 陳建國;陳川;張靜;王瑢;楊傳春;張文勇 | 申請（專利權）人： | 深圳樂土生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281 | 代理人： | 孫銀行;彭家恩 |
| 地址： | 518000 廣東省深圳市大*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基于 通量 pcr 產物 樣本 混合 文庫 構建 方法 試劑 | ||
1.一種基于高通量測序的PCR產物大樣本量混合建庫的文庫構建方法，其特征在于，包括：
(1)將來源于不同樣本DNA的多個PCR產物中的每一個，分別與帶有標簽序列的隨機引物進行退火，并在恒溫擴增酶的作用下進行恒溫擴增反應，得到能夠區分樣本來源的恒溫擴增產物，其中所述帶有標簽序列的隨機引物的序列結構如下：
X(m)N(n)，其中X(m)表示標簽序列，其長度為4～15個堿基，用于區分樣本來源；N(n)表示隨機堿基序列，其長度為6～10個堿基，用于與所述PCR產物隨機結合；
(2)將不同樣本來源的恒溫擴增產物混合，并對混合產物進行片段選擇；
(3)對所述片段選擇的產物進行5’磷酸化平末端修復和3’末端加A反應，以得到具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段；
(4)將所述DNA片段與接頭序列連接，以得到能夠區分文庫信息的連接產物，其中所述接頭序列含有用于區分文庫的條形碼序列；
(5)對所述連接產物進行PCR擴增，以得到適用于高通量測序的上機文庫。
2.根據權利要求1所述的文庫構建方法，其特征在于，所述標簽序列X(m)長度為6個堿基，所述隨機堿基序列N(n)長度為6個堿基。
3.根據權利要求1或2所述的文庫構建方法，其特征在于，所述步驟(1)中的PCR產物是目標區域特異性PCR產物。
4.根據權利要求1或2所述的文庫構建方法，其特征在于，所述步驟(1)中的PCR產物是單重或者多重PCR反應的產物，其長度大于400bp。
5.根據權利要求1或2所述的文庫構建方法，其特征在于，所述步驟(1)中的PCR產物的量是10-50ng。
6.根據權利要求1或2所述的文庫構建方法，其特征在于，所述標簽序列X(m)選自如下標簽01至標簽48所示的序列中任意一個：
名稱 序列 名稱 序列 標簽01 ACAGTG 標簽25 CTATAC 標簽02 ACTGAT 標簽26 CTCAGA 標簽03 ACTTGA 標簽27 CTTGTA 標簽04 AGTCAA 標簽28 GACGAC 標簽05 AGTTCC 標簽29 GAGTGG 標簽06 ATCACG 標簽30 GATCAG 標簽07 ATGAGC 標簽31 GCCAAT 標簽08 ATGTCA 標簽32 GGCTAC 標簽09 ATTCCT 標簽33 GGTAGC 標簽10 CAAAAG 標簽34 GTAGAG 標簽11 CAACTA 標簽35 GTCCGC 標簽12 CACCGG 標簽36 GTGAAA 標簽13 CACGAT 標簽37 GTGGCC 標簽14 CACTCA 標簽38 GTTTCG 標簽15 CAGATC 標簽39 TAATCG 標簽16 CAGGCG 標簽40 TACAGC 標簽17 CATGGC 標簽41 TAGCTT 標簽18 CATTTT 標簽42 TATAAT 標簽19 CCAACA 標簽43 TCATTC 標簽20 CCGTCC 標簽44 TCCCGA 標簽21 CGATGT 標簽45 TCGAAG 標簽22 CGGAAT 標簽46 TCGGCA 標簽23 CGTACG 標簽47 TGACCA 標簽24 CTAGCT 標簽48 TTAGGC
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