[發(fā)明專利]一種規(guī)模化生產(chǎn)小卷蛾斯氏線蟲(chóng)新方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710107652.9
• 申請(qǐng)日: 2017-02-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107006430A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李小龍;張鳳琴;何農(nóng)躍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01K67/033
• 分類號(hào): A01K67/033
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)，具體涉及一種利用嗜線蟲(chóng)桿菌與線蟲(chóng)共生的原理，通過(guò)非離體培養(yǎng)與離體培養(yǎng)相互結(jié)合，穩(wěn)定生產(chǎn)小卷蛾斯氏線蟲(chóng)F3代的新方法。

背景技術(shù)

小卷蛾斯氏線蟲(chóng)是一種以昆蟲(chóng)為寄主的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)。處于侵入期的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)能自主尋找寄主，侵入寄主的線蟲(chóng)從腸道中釋放昆蟲(chóng)致病桿菌，桿菌在寄主中大量繁殖導(dǎo)致寄主迅速死亡。國(guó)際上常用于防治害蟲(chóng)的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)主要屬于斯氏線蟲(chóng)屬和異小桿線蟲(chóng)屬。斯氏線蟲(chóng)有10個(gè)種，異小桿線蟲(chóng)有3個(gè)種。在工業(yè)化國(guó)家生物農(nóng)藥市場(chǎng)上，市場(chǎng)份額僅次于蘇云金芽孢桿菌，占第二位。這類線蟲(chóng)對(duì)土棲性害蟲(chóng)和鉆蛀性害蟲(chóng)有較強(qiáng)的殺滅作用。昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)可規(guī)模化培養(yǎng)，且使用方便，對(duì)人畜安全，不污染環(huán)境，在美國(guó)是免注冊(cè)產(chǎn)品。我國(guó)已開(kāi)發(fā)了不少殺蟲(chóng)線蟲(chóng)品種，目前處于中試推廣應(yīng)用階段，均無(wú)注冊(cè)成產(chǎn)品。

產(chǎn)業(yè)化昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)，需要高效，穩(wěn)定的病原線蟲(chóng)培養(yǎng)方法。在美國(guó)、德國(guó)等生物農(nóng)藥發(fā)達(dá)的國(guó)家一般采用液體法培養(yǎng)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)。而我國(guó)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)產(chǎn)業(yè)化起步較晚，從事昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)產(chǎn)業(yè)化的企業(yè)采用都是固體培養(yǎng)和非離體培養(yǎng)。以上兩種方法各有其局限性，使用非離體培養(yǎng)法，經(jīng)過(guò)多代培養(yǎng)后培養(yǎng)基（蟲(chóng)子尸體）易發(fā)霉，并且易染蠅蛆。采用離體培養(yǎng)法，經(jīng)多代培養(yǎng)后線蟲(chóng)質(zhì)量退化，加上培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)原生嗜線蟲(chóng)桿菌易轉(zhuǎn)變成次生桿菌。以上等等原因嚴(yán)重限制了昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的的規(guī)模化培養(yǎng)和影響了線蟲(chóng)的品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服原來(lái)技術(shù)上培養(yǎng)周期28天導(dǎo)致嗜線蟲(chóng)桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)榇紊鷹U菌這一技術(shù)難題，本發(fā)明提供了一種利用嗜線蟲(chóng)桿菌與線蟲(chóng)共生的原理，通過(guò)非離體培養(yǎng)與離體培養(yǎng)相互結(jié)合，穩(wěn)定生產(chǎn)小卷蛾斯氏線蟲(chóng)F3代的新方法。選取健康的大蠟螟末齡幼蟲(chóng)，接種小卷蛾斯氏線蟲(chóng)，一天后待大蠟螟死亡，挑選出來(lái)集中于通氣、恒溫、恒濕環(huán)境下培養(yǎng)10天，得到的線蟲(chóng)為F0代。再將F0代線蟲(chóng)接種到培養(yǎng)了2天嗜線蟲(chóng)桿菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)10天得到繁殖后的線蟲(chóng)作為F1代。最后將F1代接種于擴(kuò)大海綿培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14天得到大量的F3代作為商品線蟲(chóng)。本方法所生產(chǎn)的商品線蟲(chóng)都是F3代線蟲(chóng)，生產(chǎn)周期短，保證嗜線蟲(chóng)桿菌不轉(zhuǎn)變成次生桿菌，從而保證品質(zhì)穩(wěn)定。

具體實(shí)施方式：

下面列舉了實(shí)例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1選取健康的大蠟螟末齡幼蟲(chóng)1000條，將帶小卷蛾斯氏線蟲(chóng)的海綿放入去離子水中，攪拌多次，將海綿挑出，顯微鏡檢測(cè)線蟲(chóng)密度100萬(wàn)尾/ml，對(duì)1000條大蠟螟體表進(jìn)行接種。一天后待大蠟螟死亡，挑選一天死亡的大蠟螟，在恒溫25攝氏度下、90%濕度下恒濕環(huán)境下培養(yǎng)10天，得到的線蟲(chóng)為F0代。將F0代從大蠟螟尸體內(nèi)用無(wú)菌去離子水浸出線蟲(chóng)，再將線蟲(chóng)用無(wú)菌生理鹽水清洗3-5次，離心分離。將去雜菌的F0代50萬(wàn)尾線蟲(chóng)接種到培養(yǎng)了2天嗜線蟲(chóng)桿菌的15mm營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿營(yíng)養(yǎng)蛋白胨10%，酵母膏5%，瓊脂2%，將培養(yǎng)皿用錫箔紙封嚴(yán)，培養(yǎng)10天得到繁殖后的線蟲(chóng)作為F1代250萬(wàn)尾。選取無(wú)雜菌的F1代作種用線蟲(chóng)，含雜菌的培養(yǎng)皿直接去除。最后將F1代接種于擴(kuò)大海綿培養(yǎng)基中，海綿培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)為蟲(chóng)粉60%，速溶豆粉40%，蔗糖5%，豬油5%。培養(yǎng)14天繁殖2代，得到大量的F3代作為商品線蟲(chóng)2.5億尾。

附圖1生產(chǎn)小卷蛾斯氏線蟲(chóng)流程圖對(duì)照?qǐng)D。