[發明專利]采用De novo轉錄組分析鑒定隱甲藻中與DHA生物合成相關的脂肪酸去飽和酶基因的方法

有效

• 申請號: 201710105914.8
• 申請日: 2017-02-24
• 公開（公告）號: CN106916891B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 張衛文;陳磊;裴廣勝;劉璐
• 申請（專利權）人: 昆明藻能生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C40B50/06;G16B20/00;G16B20/30;G16B25/20
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

本發明公開了一種通過De novo轉錄組測序，轉錄本拼接和差異表達分析，鑒定蔻氏隱甲藻中與二十二碳六烯酸(DHA)生物合成相關脂肪酸去飽和酶基因的方法。具體步驟包括：(1)對隱甲藻進行DHA發酵培養；(2)收集不同生長和DHA積累階段的菌體并進行RNA提取與轉錄組Illumina深度測序；(3)測序數據的分析與預處理；(4)對拼接后的轉錄組進行功能注釋與相關性統計分析，鑒定發現隱甲藻中與DHA生物合成相關的脂肪酸去飽和酶，并獲得其基因全長序列；(5)通過qRT?PCR分析技術，對隱甲藻中與DHA生物合成相關的脂肪酸去飽和酶的基因進行表達驗證。發明為研究隱甲藻DHA的生物合成機制以及提高隱甲藻中DHA合能力成提供重要的方法和知識基礎。

技術領域

本發明屬于生物食品領域，涉及一種鑒定隱甲藻中與DHA生物合成相關的脂肪酸去飽和酶基因的方法及其應用。

背景技術

DHA即二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)是人腦發育、成長的重要物質之一，是大腦和視網膜的重要構成成分，在人體大腦皮層中含量高達20％，在眼睛視網膜中所占比例最大，約占50％。因此，它對胎兒和嬰幼兒的大腦和視網膜的發育，以及成年人腦功能的維修等方面有著重要的作用。此外，DHA對冠心病、中風、高血壓等心血管系統的疾病、神經失常、老年癡呆癥和抑郁癥等神經系統的疾病也有積極的影響。DHA作為一種必需脂肪酸，其增強記憶與思維能力、提高智力等作用更為顯著。人群流行病學研究發現，體內DHA含量高的人的心理承受力較強，智力發育指數也高。DHA還可用于癌癥治療，抑制發炎等。據荷蘭帝斯曼公司的估計，DHA的全球市場價值約為25-26.2億美元，并且以每年15％以上的速度增長。截止目前為止，深海魚油一直是市售的DHA的主要來源。但這一主要來源存在諸多缺點，比如海洋污染造成的對魚油安全性的擔憂，魚油質量會隨著魚的種類、捕撈季節和地點的不同而不同，含EPA、易受環境污染、純化成本高，魚油的特殊氣味也限制了魚油來源的DHA作為一種食品添加劑的應用。尤其是考慮到DHA的主要消費者是懷孕婦女和年幼的孩子，其可能的不利影響更令人擔憂；此外，世界漁業資源的逐年萎縮對DHA的可持續性供應的影響也值得考慮。

微藻中寇氏隱甲藻由于其快速的生長速率及較高的DHA含量、幾乎不含其它不飽和多脂肪酸等副產物、易于在實驗室條件下大規模培養等優勢，近年來在生產中的應用越來越廣泛，相關的研究也越來越深入，并逐漸可以替代傳統的從魚類產品中直接提取DHA的方法。隱甲藻作為一種原始的真核單細胞微藻，其生長周期可粗劃分為細胞生長階段和穩定時期，其中穩定期是隱甲藻積累DHA的主要階段。然而，目前隱甲藻的基因組信息尚未公布，其DHA的合成途徑尚不明確，限制了工程改造寇氏隱甲藻的各種努力。在這種情況下，Denovo轉錄組，又稱為從頭測序應運而生。該方法不需要任何現有基因組信息，就可以對某個物種的全部轉錄本進行測序，利用生物信息學分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的全部轉錄本的序列信息以及不同條件下表達響應過程。因此，利用De novo轉錄組來解析隱甲藻中DHA的生物合成途徑，特別是脂肪酸去飽和催化機制，對進一步提高隱甲藻中DHA含量具有重要指導意義。

發明內容

本發明的目的是利用二代測序技術illumina/solexa系統，對寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)轉錄組進行de novo深度測序。對測序結果進行生物信息學分析后，得到該物種轉錄組中全部與DHA合成相關的基因序列(全長或部分)。最終鑒定出DHA積累期在轉錄組水平表達量顯著變化的、和DHA生物合成相關的功能基因。

其過程主要包括如下步驟：

(1)對隱甲藻進行DHA合成的發酵培養：