[發明專利]一種通過正負電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法和應用

有效

• 申請號: 201710104570.9
• 申請日: 2017-02-24
• 公開（公告）號: CN106636016B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 張麟;孫彥;郭小翠
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

本發明公開一種通過正負電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法和應用。通過構建病毒樣顆粒結構蛋白的兩種突變體，其一通過精氨酸或者賴氨酸等酸性氨基酸引入正電荷，另一通過谷氨酸或天冬氨酸等堿性氨基酸引入負電荷，通過正負電荷間的靜電吸引提高病毒樣顆粒的自組裝效率和穩定性。通過該方法在鼠多瘤病毒樣顆粒結構蛋白VP1中引入正負電荷，獲得兩種突變體，包括帶正電的m+VP1和帶負電的m?VP1，并將兩種突變體混合進行自組裝。電子透射顯微鏡、紫外實時監測和紫外濁點變溫法等實驗證實，通過兩種突變體之間的靜電作用力，可有效提升自組裝效率和熱穩定性。

技術領域

本發明涉及通過正負電荷引入改善病毒樣顆粒自組裝和穩定性的研究及應用，屬于生物材料中的納米載體研究領域。

背景技術

病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP)是由病毒衣殼結構蛋白自組裝而形成的空心納米顆粒，不含病毒本身的核酸遺傳物質而沒有感染性。但VLP具有與天然病毒相近的結構特征，因此具有很強的免疫原性和生物學活性，適合進行相關疫苗的研發。例如，能夠抵御乙型肝炎病毒(HBV)和人乳頭瘤病毒(HPV)的VLP疫苗已經成功地應用于臨床。此外，VLP還可作為載體平臺，通過化學偶聯或基因融合的方式形成嵌合型VLP，或者包裹核酸或小分子。因此，病毒樣顆粒作為一種蛋白類的納米顆粒，在免疫學、基因診斷、藥物輸送和材料學等領域具有廣闊應用前景。例如，鼠多瘤病毒樣顆粒呈二十面體，直徑45nm，由72個向右歪斜排列的衣殼粒組成，而每個衣殼粒包含5個主要衣殼蛋白VP1。研究報道，結構蛋白VP1表達純化后通常以衣殼粒(Cap)的五聚體形式存在。鼠多瘤病毒樣顆粒目前通常使用兩步透析法進行自組裝。首先在自組裝緩沖液中透析17h，再轉入穩定緩沖液中透析24h，流程復雜。因而，提高病毒樣顆粒的自組裝效率和穩定性對其應用研究具有重大意義。

發明內容

本發明目的在于提出一種通過正負電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法和應用，該方法在鼠多瘤病毒樣顆粒的實驗驗證有效。通過該方法構建鼠多瘤病毒樣顆粒的兩種突變體，m+VP1和m-VP1，按比例直接混合后能夠自組裝。紫外檢測和濁點變溫實驗證實正負電荷引入使病毒樣顆粒自組裝效率和熱穩定性均得到提高。

本發明的技術方案如下：

一種通過正負電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法，通過構建病毒樣顆粒結構蛋白的兩種突變體，其一通過精氨酸或者賴氨酸等酸性氨基酸引入正電荷，另一通過谷氨酸或天冬氨酸等堿性氨基酸引入負電荷，通過正負電荷間的靜電吸引提高病毒樣顆粒的自組裝效率和穩定性。

本發明在鼠多瘤病毒樣顆粒改造和自組裝強化中的應用，步驟如下：

(1)通過基因工程操作在鼠多瘤病毒樣顆粒結構蛋白VP1的HI環上插入精氨酸，構建帶正電的VP1突變體(m+VP1)，通過插入天冬氨酸構建帶負電的VP1(m-VP1)，同時表達野生型VP1(wtVP1)；

(2)將構建質粒轉入大腸桿菌，發酵表達目標蛋白；

(3)菌液處理，獲得含有目標蛋白的上清液；

(4)通過GST親和柱分離純化VP1，使用凝血酶切割GST標簽，使用凝膠過濾色譜分離去除GST標簽，獲得純化的VP1；

(5)通過引入的正負電荷輔助VLP自組裝，獲得穩定性好，易于自組裝的VLP突變體，mVLP。

所述步驟(1)的方法是：在帶有VP1基因的質粒pGEX-4T中插入外源基因序列，根據大腸桿菌密碼子偏好性在VP1的HI環分別插入精氨酸密碼子和天冬氨酸密碼子，構建得質粒pGEX-4T-m-VP1和pGEX-4T-m+VP1。

所述步驟(2)的方法是：將構建質粒轉入大腸桿菌，然后接種于氨芐氨青霉素的LB培養基培養；再接種到氨芐氨青霉素的TB培養基中，養至菌懸液OD600為0.5～0.6；加入誘導劑IPTG，轉移至26℃下繼續培養20～30h，誘導外源蛋白的表達。