[發明專利]新型全內反射熒光顯微鏡入射深度的標定裝置及標定方法

在審

• 申請號: 201710103652.1
• 申請日: 2017-02-24
• 公開（公告）號: CN107014788A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 許迎科;金璐紅;劉旭
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/01;G02B21/00;G02B21/34
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于熒光顯微鏡成像領域，具體涉及一種新型全內反射熒光顯微鏡入射深度的標定裝置及標定方法。

背景技術

全內反射熒光顯微鏡(total internal reflection fluorescence microscopy,TIRFM)是近年來新興的一種光學成像技術，該技術利用全內反射時產生的隱失波來激發熒光分子，以觀察熒光標記樣品在靠近交界面的極薄區域。由于隱失波場存在能量在軸向上呈指數衰減的特性，使得可觀察區域的動態范圍通常在200nm以下，有效地控制了激發體積，大大降低了背景光噪聲干擾，因此具有其它光學成像技術無法比擬的高信噪比和對比度。故此項技術目前已廣泛應用于細胞膜表面物質的動態觀察。

根據隱失波場的特性可知，當入射角越大時，產生的隱失波場的入射深度越淺。故每張全內反射熒光顯微鏡拍攝得到的二維投影圖像中都含有豐富的三維信息。因此，確定出各個入射角對應的入射深度就顯得尤為重要。

目前市場上的商業全內反射熒光顯微鏡無法提供激發光的入射角與TIRF入射深度的對應信息。盡管全內反射熒光顯微鏡有個理論指數衰減模型，但這只是理想情況中的光學模型，并不適用于實際情況。此外，由于實驗條件的差異，不同顯微鏡的軸向衰減模型也不盡相同。所以，建議一種方便快捷的全內反射熒光顯微鏡入射深度的系統標定方法就顯得尤為重要。

目前，不少研究人員付出過精力來研究標定全內反射熒光顯微鏡的入射深度，比較常用的兩種方法是熒光小珠子法和熒光大珠子法。熒光小珠子標定法的原理圖如圖1所示，其原理是選取a，b等若干個點放置熒光小珠子，每二者距離25nm。以一定的振鏡電壓V發射光線，測量得到a，b等處熒光的光強為I(a)和I(b)。將測得光強與熒光小珠子所在位置聯立擬合曲線，得到I(z)-z曲線，根據公式(1)可以得到滲透深度d。

其難點在于需要特殊的工具來確保熒光小珠子之間的距離為25nm且需要制作工藝復雜且直徑很小的熒光小珠子。

熒光大珠子標定法的原理圖如圖2所示，其原理是一定入射角下的激發光激發的隱失波場深度一定，當熒光珠子直徑足夠大，利用拍得的投影圖即可推算出真實的入射深度。

這兩種方法雖然能得到較好的標定結果，但是需要特殊的熒光珠子或實驗工具，且后期還需要進行復雜的圖像處理數據擬合等過程，使用方法不太方便。

環狀全內反射熒光顯微鏡利用一個環狀光圈形成TIRF圖像，它的優勢在于減少了干涉條紋，快速多角度成像減少了3D成像以及單角度成像產生的色差。

EPI指的是垂直式熒光顯微鏡。激發光以近乎垂直交界面的形式入射，使得進入樣本區域的熒光強度仍舊非常強，可激發樣本上標記出的全部熒光染料。

發明內容

鑒于上述，本發明提供了一種全內反射熒光顯微鏡入射深度的標定裝置，該裝置結構簡單、成本低，操作方便靈活。

一種全內反射熒光顯微鏡入射深度的標定裝置，包括：

載玻片；

方形蓋玻片，所述方形蓋玻片蓋于所述載玻片的上表面上且右側邊對齊布置；

玻璃片，所述玻璃片置于所述載玻片上且左側邊接觸并對齊布置，所述玻璃片的下表面支撐于所述方向蓋玻片上；

所述玻璃片的下表面均勻地涂布有熒光染料。

所述的玻璃片與載玻片的尺寸相同。

作為優選，所述的玻璃片的尺寸為25mm×75mm，為了克服熒光成像的點擴散效應，玻璃片上的熒光染料的厚度為8～12nm。

作為優選，所述的載玻片為Electron Microscopy Sciences公司生產的規格為25mm×75mm的載玻片。

作為優選，所述的方形蓋玻片為FisherBrand公司生產的規格為18mm×18mm厚度為0.17mm的方形蓋玻片。

本發明還提供了一種利用上述的標定裝置對全內反射熒光顯微鏡入射深度進行標定的方法，具體步驟為：

(1)將標定裝置置于可自由切換入射角的全內反射熒光顯微鏡的載物臺上；

(2)將顯微鏡可視場區域邊界在均勻涂有熒光染料的玻璃片的相應位置設為B點，將B點距離載玻片的距離定為z₀；

(3)選擇顯微鏡可視場區域范圍內的任一一點作為標定的熒光目標點A，則熒光目標點A的實際深度Z_A可表示為：

z_A＝z₀+xtanα