[發明專利]一種檢測HLA-A*31:01等位基因的MGB探針實時熒光PCR方法及其引物探針組合

有效

• 申請號: 201710102128.2
• 申請日: 2017-02-24
• 公開（公告）號: CN106755530B
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發明（設計）人: 王會娟;劉正斌;張婷婷;康星;陳超
• 申請（專利權）人: 陜西佰美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 胡樂

1.用于多重熒光PCR反應高特異性擴增HLA-A*31:01等位基因的引物探針組合，其特征在于，包括以下目的基因的特異性引物和探針，其序列如下：

上游引物Fp：5’-GAGCCAGAGGATGGAGCC-3’ ；

下游引物Rp: 5’- CCAGGTCCACTCGGTCtA -3’；該下游引物Rp序列的倒數第二位小寫字母t表示的堿基為人為引入的錯配，以增強檢測的特異性，并且倒數第一位堿基A為HLA-A*31系列等位基因所含有的特異性堿基；

探針probe1：5’-FAM-aGGCCtGAGTATTGGGAC-MGB-3’；小寫字母a、t表示的堿基為具有特異性的堿基；

探針probe2: 5’-VIC-CCTTCACaTTCCGTGTCTC-MGB-3’；小寫字母a表示的堿基為能夠區分HLA-A*31:01等位基因和其它HLA-A*31等位基因的特異性堿基；

其中FAM為6-carboxyfluorescein; VIC為4,7,2′-trichloro-7′-phenyl-6-carboxyfluorescein；MGB為Minor Groove Binder；

該引物探針組合還包括針對內參基因設計的特異性引物和探針。

2.根據權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，所述內參基因為ACTB，相應設計的特異性引物和探針，作為內質控體系，其序列如下：

上游引物Actin-F: 5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’ ；

下游引物Actin-R: 5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’ ；

探針Actin-probe: 5’-CY5-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’ ；

其中，CY5為Cyanine dyes 5；BHQ2為Black Hole Quencher-2。

3.權利要求1或2所述的引物探針組合在制備針對HLA-A*31:01等位基因的檢測試劑盒方面的用途。

4.一種檢測HLA-A*31:01等位基因的MGB探針實時熒光PCR方法，用于非疾病診斷目的，其特征在于：包括以下環節：

（1）獲得抽提的待測樣本基因組DNA；

（2）在同一個反應體系中，將待測樣本基因組DNA與權利要求1或2所述引物探針組合按照確定比例混合；

（3）通過Applied Biosystem 7500或者ViiA? 7 Real-Time PCR System 進行實時熒光PCR檢測，其中分別利用FAM、VIC和CY5通道進行多通道熒光信號采集；

（4）分析判斷待測樣本是否攜帶HLA-A*31:01等位基因。

5. 根據權利要求4所述的檢測HLA-A*31:01等位基因的MGB探針實時熒光PCR方法，其特征在于：使用Premix Ex Taq試劑盒進行擴增，所述反應體系以20μL計，則包括：10μL 2×Premix Ex Taq，HLA-A*31:01特異性上游引物Fp: 125nM~250nM，下游引物Rp：125nM~250nM，HLA-A*31:01特異性探針probe1：10nM~20nM, probe2:20nM~40nM，以及ACTB基因特異性上游引物Actin-F：125nM~250nM，下游引物Actin-R: 125nM~250nM，探針Actin-probe:50nM~100nM；然后加入待測樣本基因組DNA 10ng~50ng，補充PCR等級的水至終體積20μL；擴增程序為：95℃預變性30s；95℃ 5~10 sec，60℃ 34~40 sec，共計40個循環。

6.根據權利要求5所述的檢測HLA-A*31:01等位基因的MGB探針實時熒光PCR方法，其特征在于：目的基因和內參基因的特異性引物和探針在熒光PCR儀96或者384孔板上加入同一孔中進行擴增，但用三個熒光通道進行熒光的采集；內參基因作為質控，必須出現熒光擴增曲線；在內參基因觀察到擴增曲線的前提下，兩條特異性探針必須同時擴增出具有設定熒光值的熒光曲線，則判定待測樣本攜帶有HLA-A*31:01等位基因。