[發明專利]一種基于KMnF4納米探針篩選厭氧菌中藥抑制劑的方法

在審

• 申請號: 201710100985.9
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN107037201A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 張錦勝;鄭洪立;趙茹;彭紅;鄒燈超;巫小丹;萬益琴
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N33/569;G01N24/08
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發明涉及一種中藥配方的篩選方法。

背景技術

抗生素在殺菌同時，也會造成人體損害，影響肝、腎臟功能、胃腸道反應等。濫用抗生素可能引起某些細菌耐藥現象的發生，對感染的治療會變得十分困難。目前，幾乎沒有一種抗菌藥物不存在耐藥現象。開發具有抗菌作用的中藥及配方具有積極意義。

許多中藥及配方藥具有抗菌消炎作用，一些中草藥的有效成分和分子結構等也已經全部或部分地研究清楚。例如黃連和黃柏止痢的主要成分小蘗堿（黃連素）、黃芩抗菌的主要成分黃芩素等等。大量事實證明，中國古代勞動人民通過長期實踐所積累起來的醫藥遺產是極為豐富、極為寶貴的。我們應當珍視這個祖國醫藥學的偉大寶庫，努力發掘，加以提高，從中可以開發具有抗菌消炎作用的中藥，可以取代或部分取代抗生素。

厭氧菌是一類在無氧條件下比在有氧環境中生長好的細菌，而不能在有空氣存在情況下生長的細菌。這類細菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無氧發酵的方式進行。它能引起人體不同部位的感染，包括闌尾炎、膽囊炎、中耳炎、口腔感染、心內膜炎、骨髓炎、腹膜炎等多種疾病。在傳統的開發針對某種厭氧菌的中藥新配方過程中，一般是在滅菌的培養基中接種厭氧菌后加入中藥組分，在特殊的厭氧培養箱中培養。一段時間后再取樣進行劃線培養，計算菌落數，從而確定某中藥組成配方是否有抑菌作用。劃線培養也需要在厭氧培養箱中培養，且培養周期至少要幾天，因此整個周期長，效率低。本方法是針對上述問題發明的一種中藥配方的快速篩選方法。

本方法的基本原理：單克隆抗體或抗原分子通過共價鍵結合，這種結合不會改變單克隆抗體、抗原的免疫學特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結合。而KMnF4材料其Mn元素外層具有多個未成對電子，具有高飽和磁化強度，在粒徑小到一定程度時，會出現超順磁特性，KMnF4納米材料會對周圍水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫時間的影響非常大，具有放大核磁共振馳豫信號的作用。非常微量的KMnF4納米材料就會造成水的核磁共振弛豫時間大幅下降。因此可以通過構建KMnF4納米探針，從磁共振的角度來做檢測是否存在目標菌，從而間接評估中藥成分的抑菌作用。

主要步驟：

1）. KMnF4納米探針制備。從市場上購買順磁KMnF4納米材料，也可以通過其他方法制備納米級的KMnF4。使用硅烷偶聯劑，其通式為:Y(CH₂)nSiX₃。此處，n為0-3；X為可水解的基團；Y為有機官能團。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，這些基團水解時即生成硅醇(Si(OH)₃)，而與無機物質結合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、環氧基、甲基丙烯酰氧基、巰基。這些反應基團可與有機物質反應而結合。因此，通過使用硅烷偶聯劑，可在無機物質和有機物質的界面之間架起“分子橋”，把兩種性質懸殊的材料連接在一起提高復合材料的性能和增加粘接強度的作用。通過硅烷偶聯劑反應可以得到表面修飾的氨基化或羧基化的KMnF4納米材料。進一步通過偶聯抗體，可實現表面功能化，形成特異性免疫探針，封閉多余的活性位點，離心分離后可以將過量的抗體分離，即可以得到抗性修飾的KMnF4納米探針。

2）. 采用聚苯乙烯材料制作的樣品管進行中藥篩選。聚苯乙烯材料與酶標板類似，探針表面抗體會由于吸附作用而結合在聚苯乙烯材料的表面，但是，探針表面的抗體吸附到聚苯乙烯材料表面的速度與探針表面抗體結合目標菌的速度相比，前者速度慢的多，兩者是競爭關系。因此，在聚苯乙烯樣品管中加入滅菌的厭氧菌的培養基，接種目標厭氧菌后加入需要篩選的中藥提取液，密閉厭氧培養一段時間后，加入步驟1）所制備的KMnF4納米探針，充分混合震蕩反應一段時間，若樣品管中有目標菌生長，則KMnF4納米探針表面的抗體首先會與目標菌結合，從而使得KMnF4納米探針留在液體中。若樣品管中沒有目標菌，則KMnF4納米探針表面的抗體會逐漸吸附在聚苯乙烯樣品管表面，從而使液體中沒有KMnF4納米探針。前已述及，微量的KMnF4納米材料就會造成水的核磁共振弛豫時間大幅下降。以無菌的沒有接種目標菌的培養基液體為空白，測得的懸濁液的弛豫時間相比有顯著降低，則說明液體中含有探針，從而間接證明樣品中有目標菌，探針的量與弛豫時間的下降值呈正比，通過加標定量探針可以間接定量出目標菌的量。有目標菌存在，則說明中藥抑菌作用不明顯，反之則說明有抑菌作用。