[發明專利]HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉及其制備和應用

有效

• 申請號: 201710099295.6
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN106880512B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 王靜;盧榮;趙文靜;胡春梅;馬雅婷
• 申請（專利權）人: 西安艾爾菲生物科技有限公司
• 主分類號: A61K8/73
• 分類號: A61K8/73;A61K8/24;A61K8/99;A61K8/64;A61Q19/00;C12N5/0775;C12N1/04
• 代理公司: 西安弘理專利事務所 61214
• 代理人: 李娜

本發明公開了一種HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，按質量百分比包括以下組分：人臍帶MSC無血清培養液活性蛋白成分5～12％，殼聚糖20～65％，三聚磷酸鈉1～15％，透明質酸20～65％，水≤5％。其制備方法為，先采用CS納米粒制備工藝將具有多種活性細胞因子的干細胞無血清培養上清液包覆，進而凍干，再使CS納米粒表面的活性氨基與HA表面的羧基發生共價偶聯反應，制得本發明產品。

技術領域

本發明屬于細胞工程技術領域，涉及一種HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，還涉及了該凍干粉的制備方法。

背景技術

干細胞美容最早是在整形外科中的應用，而整形外科中應用的較多的干細胞種類是間充質干細胞、表皮干細胞、血管內皮祖細胞及前脂肪細胞等。

傳統上所謂的干細胞美容術，一般都是直接注射干細胞針劑。而這種注射用干細胞的來源主要是從流產的胚胎中提取的，所以難免會引起免疫排斥反應，而且存在一定的倫理問題。即使是采用自體干細胞，但是在干細胞的培養擴增過程中會引入外源性的蛋白(胎牛血清)，容易引起免疫排斥反應。

人間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)在培養中分泌堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、人表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和肝細胞生長因子(HGF)在內的多種促進皮膚細胞再生的生長因子。這些具有生物活性的生長因子能夠有效的促進皮膚細胞的新陳代謝；促進細胞外透明質酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增強皮膚的親水性；促進表皮細胞的生長、分化和修復，使衰老死亡的細胞得以及時補充；同時能夠加速角質層修復，加速基底新老細胞更替，使肌膚回到年輕姿態。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，解決液態干細胞培養上清保存期有限這一瓶頸，同時解決干細胞培養上清中細胞生長因子活性保存問題。

本發明的第二個目的是提供上述人臍帶MSC無血清細胞培養液CS納米粒凍干粉的制備方法。

本發明所采用的第一個技術方案是，一種HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，按質量百分比包括以下組分：人臍帶MSC無血清培養液活性蛋白成分5～12％，CS(殼聚糖)20～65％，TPP(三聚磷酸鈉)1～15％，HA(透明質酸)20～65％，水≤5％，以上各組分的質量總和是100％。

本發明所采用的第二個技術方案是，上述HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，制備負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒；

將人臍帶MSC無血清培養液加入CS酸溶液中，并加入TPP，室溫反應。將反應后的納米粒混懸液離心，所得沉淀洗滌、冷凍干燥，得到負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒。

步驟2，制備HA修飾的負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉；

對HA中的羧基進行活化，然后將負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒加入到活化后的HA中反應，取反應后的納米混懸液，離心，所得沉淀洗滌并冷凍干燥，即得HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉。

其中，步驟1中人臍帶MSC無血清培養液的制備方法為：取新生兒臍帶，將靜脈內血跡洗滌干凈；去除表皮、兩條動脈血管及一條靜脈血管，將組織剪碎，加入含FBS的DMEM/F12培養基培養，得到原代人臍帶間充質干細胞；當細胞融合度為80％-90％時，胰蛋白酶消化細胞傳代培養，取傳代細胞，繼續培養，當細胞融合度80％-90％時，棄含FBS的培養上清，PBS洗滌細胞，加入無血清的DMEM/F12培養基繼續培養72小時，收集無血清培養液。