[發(fā)明專利]一種提高Fab抗體表達(dá)量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710099209.1
• 申請(qǐng)日: 2017-02-23
• 公開（公告）號(hào): CN106967658B
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張守濤;郭亞楠;田慶南
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N15/66;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務(wù)所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時(shí)立新

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程中提高Fab抗體表達(dá)量的方法。該方法包括：構(gòu)建重組質(zhì)粒pVEGF?Fab，制備特定的蛋白酶缺陷性細(xì)胞突變株（△pepN、△DegQ、△dcp和△pepP），轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)表達(dá)Fab抗體等步驟。本申請(qǐng)對(duì)于宿主細(xì)胞株的改造較為特殊和新穎，所制備宿主細(xì)胞株由于特定蛋白酶缺失，可較好解除對(duì)Fab表達(dá)后抑制或降解作用，從而提高Fab表達(dá)量，因而對(duì)于特定的Fab抗體表達(dá)制備具有較好地應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也為其他抗體蛋白表達(dá)和制備提供了較好的借鑒和參考，因而具有較好的實(shí)用價(jià)值和科研意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程中提高Fab抗體表達(dá)量的方法。

背景技術(shù)

細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌，E.coli)通常用于產(chǎn)生重組蛋白。細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)相比真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有成本低廉、大規(guī)模發(fā)酵容易、條件易于自動(dòng)化控制等優(yōu)點(diǎn)，通過大腸桿菌表達(dá)重組蛋白是一種高效、經(jīng)濟(jì)的途徑。使用細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)來產(chǎn)生重組蛋白還有其他許多優(yōu)勢(shì)，特別是由于細(xì)菌細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的通用性質(zhì)允許了通過質(zhì)粒的基因插入。大腸桿菌被用于產(chǎn)生許多重組蛋白，包括人胰島素和Fab抗體蛋白等。

Fab是IgG分子的抗原結(jié)合片段，是由Fd鏈與L鏈通過二硫鍵結(jié)合形成的異二聚合體。由于Fab抗體片段沒有Fc段，不需要進(jìn)行復(fù)雜的糖基化和翻譯后修飾，所以不需要通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)來生產(chǎn)。而大腸桿菌憑著自身遺傳背景清楚、易于操作、生產(chǎn)周期短、成本低且表達(dá)量高以及表達(dá)產(chǎn)物易于分離純化等優(yōu)點(diǎn)，成為大規(guī)模制備重組抗體片段最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌周質(zhì)空間中蛋白酶含量低、雜蛋白含量少，因此Fab在周質(zhì)空間中的表達(dá)更有利于生產(chǎn)制備高活性的Fab抗體。

盡管使用細(xì)菌細(xì)胞來產(chǎn)生Fab重組蛋白有許多優(yōu)勢(shì)，但仍有顯著的局限，這包括對(duì)蛋白酶敏感性較好地Fab蛋白。其原因在于，F(xiàn)ab在大腸桿菌表達(dá)中最具挑戰(zhàn)性的問題就是4個(gè)鏈內(nèi)和1個(gè)鏈間二硫鍵的形成，這關(guān)系到Fab分子結(jié)構(gòu)和功能的完整性。一般而言，蛋白酶對(duì)于大腸桿菌周質(zhì)和胞質(zhì)中舊的和錯(cuò)誤折疊的蛋白的翻換起重要作用。當(dāng)細(xì)菌蛋白酶起作用時(shí)，可對(duì)重組蛋白進(jìn)行降解，從而顯著降低活性蛋白的產(chǎn)率。在大腸桿菌中，已鑒定獲得了許多細(xì)菌蛋白酶，包括DegP-Q、Tsp、prlC、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpA、clpP、ClpX、dcp、DegS、lon等等。

對(duì)于部分蛋白研究成果列舉如下：

氨肽酶N(Aminopeptidase N，pepN)，蛋白分子量為99kDa，屬于蛋白家族M1，在其活性中心發(fā)現(xiàn)鋅離子。氨肽酶N在哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物和細(xì)菌等多種物種中具有良好的保守性。在大腸桿菌，氨肽酶N被認(rèn)為是主要的氨肽酶，它依賴ATP降解胞內(nèi)蛋白。在應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷時(shí)，氨肽酶N在蛋白降解中發(fā)揮主要作用，使降解的氨基酸成為可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，鄰菲咯啉，嘌呤霉素，烏苯美司抑制等可抑制該酶活性。

大腸桿菌degQ基因，編碼455個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)degQ，該蛋白屬于絲氨酸內(nèi)肽酶家族。應(yīng)激狀態(tài)下，degQ的主要功能是降解大腸桿菌周質(zhì)腔內(nèi)聚集的大量變性和未折疊的蛋白質(zhì)。degQ可高效打開Val-Xaa和Ile-Xaa間的肽鍵。

大腸桿菌dcp基因，編碼681個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)dcp，該蛋白屬于C端外肽酶，在其活性中心發(fā)現(xiàn)鋅離子。dcp酶具有廣泛的特異性，可以從蛋白質(zhì)及各種肽C末端切割二肽。

大腸桿菌pepP基因，編碼441個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)pepP，該蛋白屬于N端外肽酶，在其活性中心發(fā)現(xiàn)錳離子。dcp酶可以從蛋白質(zhì)及各種肽N末端釋放任何與脯氨酸相連的氨基酸殘基，包括脯氨酸。