[發明專利]一種同步檢測4種辣椒病毒的多重PCR方法

有效

• 申請號: 201710098452.1
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN106755597B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 李莉;馮耿;王錫鋒;劉文文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

1.一種同步檢測BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種辣椒病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR體系中，包含有如下特異性引物：

擴增BBWV2的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.1：5′-GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG-3′，

SEQ ID NO.2：5′-CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC-3′；

擴增PVY的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.3：5′-CGGTTCGTTTGAATGCAAGC-3′，

SEQ ID NO.4：5′-CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG-3′；

擴增ChiVMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.5：5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′，

SEQ ID NO.6：5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′；

擴增CMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.7：5′-AAANCTTGTTTCGCGCATTCA-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GAGGGAGGGTTCTGGGAACA-3′。

2.根據權利要求1所述的方法，所述PCR體系中BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV引物的摩爾比分別為2.5：1：2.5：1。

3.根據權利要求2所述的方法，所述的PCR體系總體積25μL，其中含有cDNA 2μL、10mMdNTPs 3μL、rTaq 1.5U、25mM的MgCl₂ 1.5μL以及10μmol/L的BBWV2、PVY、ChiVMV及CMV上下游引物分別為0.5μL、0.2μL、0.5μL、0.2μL。

4.根據權利要求3所述的方法，所述PCR擴增反應條件為：94℃預變性3分鐘；94℃變性30秒、57℃退火45秒和72℃延伸90秒，共40個循環；最后72℃延伸10分鐘。

5.根據權利要求1－4任一所述的方法在同步檢測農作物中四種辣椒病毒病原BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV中的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，所述農作物為辣椒。

7.一種檢測試劑盒，含有檢測BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種辣椒病毒的引物，其分別為：

擴增BBWV2的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.1：5′-GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG-3′，

SEQ ID NO.2：5′-CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC-3′；

擴增PVY的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.3：5′-CGGTTCGTTTGAATGCAAGC-3′，

SEQ ID NO.4：5′-CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG-3′；

擴增ChiVMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.5：5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′，

SEQ ID NO.6：5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′；

擴增CMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.7：5′-AAANCTTGTTTCGCGCATTCA-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GAGGGAGGGTTCTGGGAACA-3′。