[發明專利]引物對及其在楊黃纖孔菌與桑黃纖孔菌鑒別中的應用

有效

• 申請號: 201710097086.8
• 申請日: 2017-02-22
• 公開（公告）號: CN106811467B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 宋吉玲;袁衛東;陸娜;李海波
• 申請（專利權）人: 杭州市農業科學研究院;浙江省林業科學研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發明公開了一種引物對及其在楊黃纖孔菌與桑黃纖孔菌鑒別中的應用。引物對，包括上游引物和下游引物，核苷酸序列為：上游引物：5′?GAGTGCGTCGGGTGAAGACT?3′或5′?TGCGCATGTGCACGGCCTT?3′，下游引物：5′?AGGAGGTAACAACAACTCCTT?3′。本發明引物對能夠被用于鑒別楊黃纖孔菌和桑黃纖孔菌，通過對樣品的基因組DNA進行擴增，再進行普通的核酸膠電泳，如果有特異性的擴增條帶，則待檢測樣品為楊黃纖孔菌，否者為桑黃纖孔菌。使用本發明引物對來鑒別楊黃纖孔菌和桑黃纖孔菌，方法簡單、方便，結果可靠性好。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種引物對及其在楊黃纖孔菌與桑黃纖孔菌鑒別中的應用。

背景技術

桑黃纖孔菌(Inonotus sanghuang或I.sanghuang)簡稱桑黃，是一類大型真菌，隸屬于銹革孔菌目Hymenochaetales下Inonotus屬的sanghuang類群，其子實體入藥，有“森林黃金”之美稱。

桑黃始載于《本草綱目》，中醫傳統多用于治療痢疾、盜汗、血崩、血淋、臍腹澀痛、脫肛瀉血、帶下、閉經等癥。近年來由于發現其具有免疫調節以及抗腫瘤作用，逐漸成為研究開發的熱點，日韓等國桑黃應用及產品開發豐富，如采用發酵罐人工生產桑黃菌絲體，并提取桑黃有效成分，以凍干粉為劑型，作為抗腫瘤藥品；同時將桑黃廣泛應用于護膚和保健產品中。目前我國對桑黃的研究及應用尚處于產業發展初期。

桑黃纖孔菌(Inonotus sanghuang或I.sanghuang)的鑒別特征為子實體蓋形，木質，淺肝褐色至暗灰色或灰色，腹面呈黃色，擔孢子4.0～4.9μm×3.1～3.9μm，野外僅生長在桑屬(Morus)的樹干。

楊黃纖孔菌(Inonotus vaninii或I.vaninii)簡稱楊黃，隸屬銹革孔菌目Hymenochaetales下Inonotus屬的sanghuang類群，分布于中國地區。楊黃纖孔菌的鑒別特征為子實體無柄，菌蓋平伏至蓋形，木質，淺肝褐色至暗灰色或灰色，腹面呈黃色，擔孢子3.8～4.4μm×2.8～3.7μm，野外僅生長在楊屬(Populus)的樹干。

對楊黃纖孔菌與桑黃纖孔菌的辨別主要通過子實體形態上的些許差異，但對子實體形態差異的判別具有很強的主觀性，常常出現偏差，而且對于干標本、模式標本很難僅僅通過子實體形態、顏色差異來準確鑒定。

由于楊黃纖孔菌與桑黃纖孔菌在形態特征、顏色上的差別并不顯著，因而在過去的很多年里，將楊黃纖孔菌錯誤的認為桑黃纖孔菌的情況經常有發生，有大量文獻對此有過記載。事實上，楊黃纖孔菌與桑黃纖孔菌并非同種，其中桑黃纖孔菌才是古代醫書中記載的正宗桑黃，這一結論后來也得到了分子數據的支持。

對楊黃纖孔菌和桑黃纖孔菌這二個相似種辨別的主要特征是宏觀上并不顯著的子實體外觀形態和顏色差異。但由于子實體外觀形態和顏色差異易受到生境、氣候、子實體生長期、生理狀況等的影響而常常導致主管判別上的偏差，而對于長期保藏的干標本，特別是對古老標本、模式標本的重新鑒別研究，僅憑子實體外觀更是難以準確鑒定。因此，在大型真菌分類研究上，分子技術已成為了對標本輔助鑒定的重要手段。

真菌的核糖體基因rRNA的內轉錄間隔區(Internal Transcribed Spacers，ITS)的保守性基本上表現為種內相對一致，種間差異比較明顯，這一特點使得ITS區段不僅適合于屬內物種間或種內差異較明顯的菌群見的系統發育分析，而且非常適合于真菌物種的分子鑒定。對楊黃纖孔菌和桑黃纖孔菌的ITS測序結果顯示，楊黃纖孔菌和桑黃纖孔菌的ITS1-5.8S-ITS2序列分別為814bp和773bp，堿基相差40bp左右，很難利用通用引物對(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4)的PCR擴增、普通電泳來進行準確辨別。

發明內容