[發明專利]一種高效擴增NK細胞的方法

在審

• 申請號: 201710096536.1
• 申請日: 2017-02-22
• 公開（公告）號: CN106754730A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 袁彩艷;吳衛成;劉根桃;吳國祥;柴勛
• 申請（專利權）人: 上海科醫聯創生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0783;C12N13/00
• 代理公司: 上海申新律師事務所31272
• 代理人: 俞滌炯

技術領域

本發明涉及一種細胞培養方法，尤其涉及一種高效擴增NK細胞的方法。

背景技術

自然殺傷細胞(Natural Killer cell，NK cell)是T細胞、B細胞之外的第三大類淋巴細胞，是人體免疫系統的第一道防線，在機體抗病毒感染和抗腫瘤免疫中起重要作用。NK細胞識別靶細胞無MHC限制性，可以在無預先致敏的情況下殺傷腫瘤細胞或病毒感染細胞。同時，還可以產生一系列的細胞因子進而對機體的獲得性免疫進行調節，是連接機體固有免疫和特異性免疫的橋梁。NK細胞由于具有直接殺傷活性和免疫調節活性，而一度成為免疫細胞過繼療法的新熱點。此外，還有越來越多的報道將原代NK細胞或NK細胞系進行基因改造以提高其殺傷腫瘤細胞的特異性和活性，進而進行過繼免疫治療，在動物實驗和臨床試驗中均取得了良好的效果。可見，NK細胞在腫瘤的生物治療中具有廣闊的應用前景。

NK細胞的殺傷功能及療效與其數量直接相關，然而NK細胞在外周血中比例小，約占外周血PBMC的5％～10％，傳統的使用的野生型IL-2擴增NK細胞的方案，不僅NK擴增倍數有限，端粒酶活性降低，而且擴增后NK細胞的各種活化受體或CD16分子表達丟失導致NK細胞毒性減弱；最近的研究發現，野生型IL-2還可以擴增Treg細胞，而Treg細胞能夠顯著抑制NK細胞的殺傷作用，從而影響NK細胞的臨床療效。盡管國外已有商品化的NK細胞分離試劑盒，利用這些試劑，通過FACS分選或MACS法純化可獲得90％以上純度的NK細胞。但操作復雜，費用昂貴，且高度純化的NK細胞不能在體外大量擴增，難以滿足臨床試驗的需求。之前有文獻報道，采用K562細胞轉染跨膜IL-21和CD137復合體與體外PBMC共培養擴增NK細胞，使得NK細胞數量、純度和活性顯著增強。然而，腫瘤微環境是一個復雜的綜合系統，在腫瘤微環境中存在有大量的腫瘤相關巨噬細胞和CD19+B細胞，這些細胞為腫瘤細胞的生長提供營養因子。用僅轉染跨膜IL-21和CD137復合體的K562細胞激活擴增NK細胞雖然對腫瘤細胞有很強的殺傷能力，但是對腫瘤微環境中的腫瘤細胞相關巨噬細胞和B細胞的殺傷能力卻很弱。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種利用人IL-2突變體聯合K562細胞高效擴增NK細胞的方法。該方法操作簡單，擴增的NK細胞具有純度高、數量大、殺傷活性好等優點，適合于NK細胞大規模制備，為NK細胞過繼性免疫治療應用于臨床打下了良好的基礎。

本發明的一種利用人IL-2突變體聯合K562細胞高效擴增NK細胞的方法，包括：

(1)使用慢病毒轉染系統將CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的基因同時轉染K562細胞；載體中含有病毒啟動子和選擇標記基因；

(2)當外源表達載體進入宿主細胞后，激活啟動子，體外培養K562細胞一段時間后，經流式細胞術分選，獲得穩定表達跨膜蛋白CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程細胞；

(3)將穩定表達CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程細胞經過γ射線照射滅活，作為NK細胞的滋養細胞；

(4)分離并提取外周血單個核細胞(即PBMC)并計數，按一定的比例(K562:PBMC)加入滅活的K562滋養細胞，在IL-2突變體協同作用下，與PBMC共培養2～3周，即可得到純度較高的NK細胞。

其中，步驟(1)所述的CD8α為在細胞膜上表達的膜蛋白，CD8α基因連接IL-21基因后使得IL-21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；而CD19、CD137L、CD86、和CD64為膜蛋白。

步驟(2)所述的純化后的K562工程細胞其跨膜CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的表達量在85％以上。

步驟(3)所述的滅活K562工程細胞的γ射線劑量為100Gy，輻照時間為20～30min。

步驟(4)所述的IL-2突變體是通過對氨基酸定點替代，將其IL2α受體結合點突變，突變的位點在IL-2的37，38，41，42，43，44，45，61，62，65，68和72氨基酸位點。不僅能夠其降低誘導調節性T細胞的功能，同時還保留了其對NK細胞的免疫活性，可用于刺激免疫系統，從而提高其臨床療效和應用范圍。