[發(fā)明專利]提高安絲菌素P-3生物合成產(chǎn)量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710095370.1
• 申請日: 2017-02-22
• 公開（公告）號: CN108456689B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鐘建江;杜志強
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12P17/18
• 代理公司: 上海交達專利事務(wù)所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種提高安絲菌素P-3生物合成產(chǎn)量的方法，其特征在于，通過構(gòu)建共表達asm13-17基因和asmUdpg基因所對應(yīng)的整合型表達質(zhì)粒pIB139-asm13-17:asmUdpg，并將上述表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)中，實現(xiàn)生物合成表達量的提高；

所述的asm13-17基因是甲基丙二酰ACP合成酶基因，如Seq No.1所示；所述的asmUdpg基因是UDP-葡萄糖磷酸酶基因，如Seq No.2所示；

所述的質(zhì)粒構(gòu)建，具體過程步驟包括：

①PCR擴增珍貴橙色束絲放線菌目的片段基因，將目的片段插入T載體中，采用NdeI/EcoRI酶切并連接至含有紅霉素啟動子PermE*的pIB139載體中，得到pIB139-asm13-17、pIB139-asmUdpg以及pIB139-asm13-17: asmUdpg質(zhì)粒；

②將共表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有pUZ8002質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567中，然后將等量混合收集大腸桿菌ET12567/PUZ8002和預(yù)先培養(yǎng)的珍貴橙色束絲放線菌ATCC31565菌絲體混合均勻，再通過平板培養(yǎng)得到突變株結(jié)合子；

③通過阿泊拉霉素抗性進行重組菌株的篩選，并通過PCR產(chǎn)物片段進一步驗證得到橙色束絲放線菌的重組菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，實現(xiàn)安絲菌素P-3生物合成產(chǎn)量的提高；

所述的pIB139-asm13-17，具體通過以下方式得到：以137F/137R引物通過PCR擴增得到長度為4,451 bp的兩端含有NdeI/EcoRI酶切位點的asm13-17片段，將得到的基因片段，連接到pMD^@19-T載體上，得到asm13-17-19T；通過NdeI/EcoRI酶切，與相應(yīng)酶切后的pIB139質(zhì)粒的連接，得到用于asm13-17基因表達的質(zhì)粒pIB139-asm13-17；

所述的137F/137R引物包括：asm13-17-上游引物(137F)，如Seq ID No.3所示，具體為：5’- GGGAATTCCATATGGTGCCCGGCGACACCGAC -3’；asm13-17-下游引物(137R)，如Seq IDNo.4所示，具體為：5’- CCGGAATTCTCACTGGTCTCCAAGGCGCG -3’，其中劃線部分是相應(yīng)的酶切位點；

所述的pIB139-asmUdpg，具體通過PCR擴增珍貴橙色束絲放線菌ATCC31565基因組中asmUdpg基因，具體為：在珍貴橙色束絲放線菌asmUdpg基因片段兩端設(shè)計UdF/UdR引物，分別在基因前后分別加上NdeI和EcoRI酶切位點，將擴增到的不帶原始啟動子的asmUdpg片段插入T載體中構(gòu)建的UDP-T質(zhì)粒；用NdeI和EcoRI將asmUdpg片段切下插入含有紅霉素啟動子PermE*的pIB139載體中，得到pIB139-asmUdpg質(zhì)粒；

所述的UdF/UdR引物包括：Udpg-上游引物(UdF)，如Seq ID No.5所示，具體為：5’-CGCCATATGGCAGGACAGCCTAAGGAC -3’;Udpg -下游引物(UdR)，如Seq ID No.6所示，具體為：5’- CCGGAATTCTGTGCTCATACCTCGTTCATGC -3’；

所述的pIB139-asm13-17: asmUdpg，具體通過用含有酶切位點的MunI-ermE-F/UdR-EcoRI引物以pIB139-asmUdpg質(zhì)粒為模板擴增(MunI)-PermE-asmUdpg-(EcoRI)片段，連接T載體后構(gòu)建UDP-T2質(zhì)粒，用MunI和EcoRI將PermE-asmUdpg片段切下插入EcoRI單酶切的pIB139-asm13-17質(zhì)粒中，驗證方向后，得到pIB139-asm13-17: asmUdpg質(zhì)粒；

所述的ermE-F/UdR引物包括：ermE-上游引物(ermE-F)，如Seq ID No.7所示，具體為：5’- CCGCAATTGTATGCATGCGAGTGTCCGTT -3’,其中劃線部分是相應(yīng)的酶切位點。