[發明專利]一種檢測鮭魚甲病毒的TaqMan熒光定量PCR試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710092899.8
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN106755594A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 劉敏;李一經;施文;唐立杰;徐義剛;宋傲臣
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,馬鑫

1.一種用于檢測鮭魚甲病毒的TaqMan熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示的引物以及核苷酸序列為SEQ ID NO:4所示的探針，所述探針序列的5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅基團。

2.根據權利要求1所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述報告熒光基團為FAM，所述淬滅基團為BHQ1。

3.根據權利要求1所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括TaqMan熒光定量PCR擴增緩沖液。

4.根據權利要求3所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述TaqMan熒光定量PCR擴增緩沖液為Premix Ex Taq Master Mix。

5.根據權利要求1-4任一項所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括總RNA提取試劑、反轉錄試劑、陽性對照和陰性對照，所述的陽性對照為含有鮭魚甲病毒E2基因的重組質粒標準品，所述的陰性對照為去離子水。

6.如權利要求1-5任一項所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，用于檢測鮭魚甲病毒時，包括以下步驟：

(1)將待測樣本勻漿，離心，取上清進行總RNA提取；

(2)以步驟(1)得到的總RNA為模板，反轉錄合成總cDNA，總cDNA樣品保存至-80℃，備用；

(3)以步驟(2)得到的總cDNA、陽性對照品和陰性對照品分別為模板，在熒光定量PCR儀上進行PCR擴增；

(4)PCR反應結束后，根據擴增動力學曲線判斷結果。

7.如權利要求6所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，PCR擴增反應體系為：2×Premix Ex Taq Master Mix 12.5μl，濃度為10μM的上游引物及下游引物各0.5μl，探針1μl，模板2μl，去離子水8.5μl。

8.如權利要求6所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，實時熒光定量PCR的反應程序為：(1)95℃預變性30s；(2)95℃變性5s、60℃退火30s，共40個循環。

9.如權利要求6所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，在檢測中兩種對照為有效擴增時，樣本結果判斷標準如下：Ct值≤40.0時樣品結果為陽性；Ct值＞40.0的樣品結果為陰性。

10.權利要求1-9任一項所述的TaqMan熒光定量PCR試劑盒在制備檢測鮭魚甲病毒的試劑中的應用，其中，優選的，所述的鮭魚甲病毒包括以下六個基因型：SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV 5以及SAV 6。