[發明專利]一種用于表觀遺傳分析的設備和方法

在審

• 申請號: 201710092823.5
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN106834105A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 劉立琨;岳麗玲;劉溪;朱文斌
• 申請（專利權）人: 齊齊哈爾醫學院
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙)61223
• 代理人: 潘宏偉

1.一種用于表觀遺傳分析的設備，包括箱體(1)，其特征在于：所述箱體(1)的內腔設置有通道(2)，所述通道(2)的內腔頂部設置有光源裝置(3)，所述通道(2)的內腔底部設置有接觸裝置(4)，所述箱體(1)的頂部左右兩側分別設置有控制器(5)和顯示屏(6)，所述箱體(1)的左側設置有激光器(7)，所述控制器(5)分別與光源裝置(3)、接觸裝置(4)、顯示屏(6)和激光器(7)電性連接。

2.根據權利要求1所述的一種用于表觀遺傳分析的設備，其特征在于：所述通道(2)為亞微米通道。

3.根據權利要求1所述的一種用于表觀遺傳分析的設備，其特征在于：所述激光器(7)的右壁安裝有激發濾光器。

4.根據權利要求1所述的一種用于表觀遺傳分析的設備，其特征在于：所述接觸裝置(4)為微流控設備。

5.一種用于表觀遺傳分析的方法，其特征在于：該種用于表觀遺傳分析的方法步驟如下：

S1：提取染色質樣品：挑單菌落，接種于YPD培養基中過夜培養，將YPD培養基置于25-30℃下保存，取一只150mL燒瓶，將過夜培養的菌液稀釋至40-60mL,然后將燒瓶在25-30℃下培養，用終濃度為2％的甲醛交聯細胞30-40min，加入終濃度為125mM的甘氨酸，反應4-10min，使反應猝熄，收集細胞，用20-30mL的PBS緩沖液清洗菌體1-2次，重懸菌體，取一只15mL的圓錐試管，將菌體重懸于組成的溶液中，加入終濃度為0.20-0.30mg/mL的酵母裂解酶進行震蕩，得到原生質體，向原生質體溶液中加入微球菌核酸酶稀釋，再加入SDS和EDTA終止反應，在60-70℃過夜保存，再用氯仿抽取DNA，用無水乙醇沉淀DNA，再加入80-100μl的TE溶解DNA，-20℃保存備用；

S2：序列特異性探針標記染色質：先用適量的DNaseI在二價鎂離子存在下，在雙鏈染色質上打開單個單鏈缺口，利用DNA聚合酶的核酸外切酶活性在切處將舊鏈從末端逐步切除，同時在DNA聚合酶活性的作用下，順序將特異性探針連接到切口的末端氫氧基上，以互補的DNA單鏈為模板合成新的DNA單鏈；

S3：MBD1標記染色質：將MBD1的甲基化敏感的結合域MBD被克隆到pET-30b質粒，以產生在IPTG誘發下表達的His-tag融合蛋白，溶解IPTG誘發的大腸桿菌，且純化并在鎳柱上再折疊融合蛋白，在純化之后，使用標記游離胺的微刻度標記試劑盒用Alexa488來標記融合蛋白，進行三次另外的樹脂純化循環以更好地將游離標記純化掉，用Southwestern槽的印跡來測定所標記的MBD探針的完整性，以50ng/μL懸浮在1x的Tris緩沖鹽水中的甲基化的DNA和未甲基化的DNA的混合物中，我們使用TOTO-3來進行DNA染色，然后，將約1μg的經標記的DNA稀釋到包含具有2％牛血清蛋白和0.1％TritonX-100(v/v)的1x的TBS的20μL的緩沖液中，然后，將以280ng/μL儲存的且用AlexaFluor488標記的1μL的MBD1的容積添加到DNA以便在摩爾過量的條件下進行結合反應；結合反應在室溫下發生2-3小時；

S4：染色質樣品與通道接觸：將樣品保持在它們相應的儲存緩沖液中，直到DNA標記和MBD結合反應，在這些反應之后，連續地將樣品稀釋在1x的TBE，89mM的TRIS硼酸鹽和2mM的EDTA，最終的稀釋將樣品懸浮在600pM的估計濃度，標稱為對于染色質樣品為1-2ng/μL，且對于甲基化的DNA樣品為約0.25ng/μL，緩沖液中的聚合物添加劑用于限制電滲流并防止與流控通道壁的非特異性相互作用而不使得蛋白質變性，我們將50μL的樣品溶液加載到流控通道陣列的輸入儲器中，且然后連接到陰極，輸出儲器僅包含緩沖液溶液，且連接到陽極，對于所有的染色質樣品，在偏置電壓下，且對于所有的甲基化的DNA樣品，在偏置電壓下，使得樣品在20-30min的預流時間期間建立穩定的電動流動，以確保在數據收集之前已經實現穩態流條件，檢查每一種樣品達總計15min，總是使用陣列內的相同流控通道，在單分子探測之后，在加載下一個樣品之前，反復沖洗流控通道陣列達總計30min，且然后檢查以驗證熒光標記的分子的消失；

S5：測試與分析：將序列特異性探針標記的染色質和MBD1標記的染色質流過通道(2)，利用光源裝置(3)照亮通道(2)以產生多個探詢容積，每一個探詢容積由通道(2)的壁和光束限制，探測來自多個的相同或不同探詢容積的至少一個標記和一個其他標記，以產生至少一個標記和至少一個其他標記的時間相關的分辨率，利用激光器(7)在通道(2)內的溶液中的DNA樣品流動、用高斯形狀的激光剖面照亮樣品和探測表示組蛋白或DNA組分的熒光事件，控制器(5)被編程為提供來自一個或多個探詢容積的至少兩種類型的信號的實時的時間相關的分辨率，由此表征物體，顯示屏(6)其配置成接收來自處理器的數據和顯示數據，其中數據包括關于來自一個或多個探詢容積的至少兩種類型的信號的信息。