[發明專利]一種攜帶抗腫瘤蛋白靶向性exosome的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201710090715.4
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN106893697A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 宋凌;楊曉莉;王鐘輝;李娜;王春艷
• 申請（專利權）人: 商丘醫學高等專科學校
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C07K19/00;A61K38/17;A61K47/66;A61P35/00;A01K67/027
• 代理公司: 北京志霖恒遠知識產權代理事務所(普通合伙)11435
• 代理人: 劉子成

技術領域

本發明涉及到分子細胞生物學技術領域，尤其涉及一種攜帶抗腫瘤蛋白靶向性exosome的制備方法及其應用。

背景技術

近年來，以干細胞特別是以間充質干細胞(MSC)(脂肪干細胞是間充質干細胞中的一種，相比其他間充質干細胞脂肪干細胞擁有取材方便，無倫理學限制等優勢)為基礎的皮膚再生醫學研究得到廣泛關注，研究表明MSC對組織損傷有良好的修復作用，盡管其機制尚未完全闡明，但初步結果顯示可能與損傷的刺激及局部創面微環境中各種細胞因子有關，它們通過促進MSC趨化以及誘導MSC向所需要的組織或細胞分化來參與損傷組織的修復，因此在組織的修復中具有臨床應用前景。然而，MSC植入體內后存在長期應用安全性問題以及儲存和運輸困難等問題極大的限制其臨床應用。

隨著研究的深入發現MSC發揮組織損傷修復的一個重要機制是旁分泌效應，在促進創面愈合過程中比細胞轉分化起的作用更大。其旁分泌中最有效的活性成分是MSC分泌的exosome，在細胞信息傳遞中起著非常重要的作用，這一機制的提出為基于各種來源MSC的非細胞治療奠定了重要基礎。

微囊泡結構exosome是近年來發現的細胞間信號通訊的重要途徑，通過細胞外多胞體(MBV)分泌到胞外，是細胞可溶性細胞因子外的重要旁分泌形式，exosome的特征主要有：(1)直徑為30-100nm；(2)具有來源細胞的胞質和脂質膜成分；(3)含有來源細胞特異性蛋白以及相關蛋白如CD63，CD9，CD81等。exosome成分主要包括：microRNA、mRNA，蛋白等，研究表明不同來源的exosome的組成亦有差異，說明其功能的復雜性。由此可見，作為非細胞治療的重要成分，exosome在促進皮膚損傷修復中具有重要作用。MSC分泌的exosome與MSC相比具有許多優勢：(1)exosome通過細胞內吞作用攝入細胞，可以避免一些大分子(如蛋白質，RNA)因細胞膜通道阻擋而不易被細胞吸收的問題，具有生物活性高，作用效率高的優點；(2)exosome在-80℃長期穩定保存，攜帶的含有生物活性的有效成分受exosome脂質膜保護，不易被破壞，且便于運輸和儲存；(3)易于掌握臨床應用時間，亦易于控制使用濃度、劑量及途徑；(4)克服了MSC在體內存活率低及長期應用突變致瘤的潛在隱患；(5)由于其體積小避免了強烈的免疫排斥等并發癥。

因此，MSC來源的exosome在組織損傷修復中的作用及機制研究就顯得特別重要，特別是將脂肪干細胞分泌的exosome進行提取純化的研究更具有重要的意義。

exosome是直徑約為30-100nm、密度為1.13-1.21g/m1的囊泡，是由細胞分泌的納米級顆粒，外泌體廣泛天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳及體外細胞培養液。外泌體最早由Trams等于1981年在正常細胞和腫瘤細胞培養上清液中被發現。外泌體屬于生物體內囊泡的一種，早期的研究認為，外泌體執行蛋白運輸功能，特異靶定受體細胞，交換蛋白和脂類或引發下游信號事件。直到2007年，研究人員發現外泌體也運輸核酸，參與細胞間通訊。2013年美國、德國3位科學家James、Randy W和Thomas C因發現細胞內的主要運輸系統——囊泡運輸的調節機制，榮獲2013年諾貝爾生理學或醫學獎。外泌體由于攜帶多種蛋白質、miRNA、ncRNA，作為細胞物質運輸的載體發揮重要的生物學功能。例如，腫瘤細胞分泌的外泌體能夠介導血管再生腫瘤細胞增殖及免疫逃逸，而樹突狀細胞源性外泌體則能夠引起機體有效的抗腫瘤免疫應答。目前研究發現，外泌體內含有與細胞來源相關的蛋白質、RNA等，成為細胞物質運輸的天然載體，2011年Matthew等人通過構建攜帶沉默siRNA-BACE1的人工外泌體，將藥物突破血腦屏障靶向送入大腦細胞，可見外泌體有望成為一種新型天然的理想藥物運輸載體。