[發(fā)明專利]一種TCS-穿膜肽-腫瘤蛋白酶底物肽融合蛋白、其制備方法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710090518.2
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN108456254B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃永焯;陳應之
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院上海藥物研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C07K1/107;C07K1/18;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 北京金信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11225
• 代理人: 劉鋒;鄭丹

1.一種TCS-穿膜肽-腫瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳鐵蛋白連接物，所述連接物由TCS-穿膜肽-腫瘤蛋白酶底物肽融合蛋白定點與乳鐵蛋白連接修飾而制備，所述乳鐵蛋白作為腫瘤靶向配基修飾在所述TCS-穿膜肽-腫瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的C末端；所述TCS-穿膜肽-腫瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的巰基與所述乳鐵蛋白的馬來酰亞胺共價連接，

其中，所述TCS-穿膜肽-腫瘤蛋白酶底物肽融合蛋白中，TCS 的C端融合穿膜肽，然后與腫瘤蛋白酶底物肽融合，其中，所述TCS、穿膜肽、腫瘤蛋白酶底物肽序列之間各有3~10個甘氨酸作為連接序列；

其中，所述的腫瘤蛋白酶底物肽為MMP-2底物肽；

所述的TCS-穿膜肽-腫瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的氨基酸序列為MDVSFRLSGATSSSYGVFISNLRKALPNERKLYDIPLLRSSLPGSQRYALIHLTNYADETISVAIDVTNVYIMGYRAGDTSYFFNEASATEAAKYVFKDAMRKVTLPYSGNYERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSAITTLFYYNANSAASALMVLIQSTSEAARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLAIISLENSWSALSKQIQIASTNNGQFESPVVLINAQNQRVTITNVDAGVVTSNIALLLNRNNMAGGGVSRRRRRRGGRRRRGGGPLALAG。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TCS-穿膜肽-腫瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳鐵蛋白連接物的制備方法，包括如下步驟：

（a）將包含編碼TCS-穿膜肽-MMP-2底物肽融合蛋白的基因的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，得到含有重組質(zhì)粒的菌株；

（b）將含有重組質(zhì)粒的菌株用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導目的蛋白表達；

（c）離心收集菌體并超聲破碎；

（d）離心，收集含有目的蛋白的上清液；將所述上清液用幾丁質(zhì)柱親和純化，洗去雜蛋白后，用含有L-半胱氨酸的緩沖液進行柱上切割過夜，收集洗脫液；

（e）將洗脫液超濾濃縮并除去溶液中的游離半胱氨酸，即得到TCS-穿膜肽-MMP-2底物肽融合蛋白；

（f）將乳鐵蛋白與馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺按摩爾比1:3~1:20 在PBS 溶液中進行反應，于室溫中反應0.5~4小時，并用脫鹽柱除去多余的馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺，得到活化后的乳鐵蛋白；

（g）將所述的TCS-穿膜肽-MMP-2底物肽融合蛋白與步驟（f）中活化后的乳鐵蛋白按摩爾比1:5~1:20 進行反應，于4 攝氏度反應過夜；

（h）用陽離子交換柱來分離純化從步驟（g）中得到的TCS-穿膜肽-MMP-2底物肽融合蛋白-乳鐵蛋白連接物。

3.權(quán)利要求1 所述的TCS-穿膜肽-腫瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳鐵蛋白連接物在制備治療腫瘤的藥物中的用途。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于：所述腫瘤為MMP-2酶高表達的惡性腦膠質(zhì)瘤。