[發明專利]基于ARMS-PCR法檢測人外周血游離DNA中septin9基因甲基化的熒光PCR試劑盒及體系

有效

• 申請號: 201710090052.6
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN106947805B
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發明（設計）人: 黃臨迷;宋卓;袁夢兮
• 申請（專利權）人: 人和未來生物科技（長沙）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

1.一種基于ARMS-PCR法檢測人外周血游離DNA中septin9基因甲基化的熒光PCR試劑盒，其特征在于，包括：

（1）用于檢測septin9基因甲基化的特異性引物及其探針序列：

上游引物序列為：ATTCGTTGTGTATTAGTTATTATdITC（SEQ ID NO：1），

熒光探針序列為：ATTTCGCGGTGACCGCGTA（SEQ ID NO：2），

下游引物序列為：GCAACAACCAACCCAACdICC（SEQ ID NO：3）；

其中，所述引物序列中的dI表示脫氧次黃嘌呤核苷酸；所述熒光探針序列的5’端具有熒光基團，3’端具有淬滅基團和小溝結合分子；

（2）Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg²⁺和PCR緩沖液；

（3）第一添加劑和第二添加劑，所述第一添加劑包括牛血清白蛋白，所述第二添加劑包括二甲基亞砜、NH₄Cl和山梨糖醇水溶液。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：（4）用于檢測作為內標的ACTB基因甲基化的特異性引物及其探針序列：

上游引物序列為：AAAGGGTGTAGTGTTGGGAGGTTA（SEQ ID NO：4），

熒光探針序列為：TCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTT（SEQ ID NO：5），

下游引物序列為：AAAACCAACCACAAAACAA（SEQ ID NO：6）；

其中，所述熒光探針序列的5’端具有熒光基團VIC，3’端具有淬滅基團BHQ1。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團是FAM，所述淬滅基團是BHQ1。

4.一種基于ARMS-PCR法檢測人外周血游離DNA中septin9基因甲基化的熒光PCR反應體系，其特征在于，每50μL所述熒光PCR反應體系包括：

（1）10μM的引物序列各1μL，10μM的探針序列各1.5μL；其中，所述引物序列和探針序列包括：

用于檢測septin9基因甲基化的特異性引物及其探針序列：

上游引物序列為：ATTCGTTGTGTATTAGTTATTATdITC（SEQ ID NO：1），

熒光探針序列為：ATTTCGCGGTGACCGCGTA（SEQ ID NO：2），

下游引物序列為：GCAACAACCAACCCAACdICC（SEQ ID NO：3）；

其中，所述引物序列中的dI表示脫氧次黃嘌呤核苷酸；所述熒光探針序列的5’端具有熒光基團，3’端具有淬滅基團和小溝結合分子；

（2）Taq酶、UNG酶共2個單位；10mM的dNTPs和2.5mM的dUTP 0.4μL；50mM的Mg²⁺ 1.5μL；10×PCR緩沖液5μL；

（3）第一添加劑2μL，第二添加劑1.25μL，所述第一添加劑包括10mg/mL牛血清白蛋白，所述第二添加劑包括二甲基亞砜、250mM NH₄Cl和60%山梨糖醇水溶液；

（4）作為模板的轉換處理后的人外周血游離DNA 20~40ng，其中，所述轉換是對含有所述septin9基因的人外周血游離DNA中的CpG位點進行轉換處理，使得未甲基化的CpG位點轉換為UpG；以及

（5）余量的水。

5.根據權利要求4所述的熒光PCR反應體系，其特征在于，所述每50μL所述熒光PCR體系中還含有：

（6）10μM的內標的引物序列各1μL，以及10μM的內標的探針序列0.5μL，其中所述內標的引物序列和探針序列包括ACTB基因甲基化的特異性引物及其探針序列：

上游引物序列為：AAAGGGTGTAGTGTTGGGAGGTTA（SEQ ID NO：4），

熒光探針序列為：TCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTT（SEQ ID NO：5），

下游引物序列為：AAAACCAACCACAAAACAA（SEQ ID NO：6）；

其中，所述熒光探針序列的5’端具有熒光基團VIC，3’端具有淬滅基團BHQ1。