[發明專利]一種直接PCR檢測豬支原體肺炎病原的試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710089548.1
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN107058506A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 李海利;徐引弟;王治方;張青嫻;朱文豪;方劍玉;侯自花
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司32102
• 代理人: 何朝旭,朱磊

技術領域

本發明涉及一種試劑盒及其應用，尤其涉及一種直接PCR檢測豬支原體肺炎病原的試劑盒及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

豬支原體肺炎(mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)，又稱豬地方流行性肺炎(swine enzootic pneumonia)，俗稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病。主要臨診癥狀為咳嗽和氣喘，病理變化特征是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈肉樣或蝦肉羊實變。本病廣泛分布于世界各地，主要特點是高接觸性、高傳染性、高發病率和低死亡率為主要特點。臨床主要表現為咳嗽，氣喘，呼吸困難，日增重減少，長期生長不良，飼料報酬率大幅下降。該病常與其他呼吸道病原如多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌或胸膜肺炎放線桿菌等病原協同引起豬地方性肺炎，常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒和豬圓環病毒2型的協同感染引起豬呼吸道綜合征。MPS發病率一般在50％-80％，個別新建豬場發病率可達100％，死亡率高達14％-37％。流行后期或老疫區則以哺乳仔豬和斷奶小豬多發，死亡率較高，母豬和成年豬多呈慢性和隱性感染。病豬與健康豬群混合飼養，常引起豬支原體肺炎的爆發。本病目前尚無特效藥物療法，主要采取綜合防制措施及對癥療法。最根本的辦法是消除患病動物和徹底消毒，切斷傳播途徑。因此應加強檢疫和本病監測，以防本病擴散。支原體可在豬群中持續存在，各種年齡的豬都易感。本病主要在冬季多發，夏季也可發生。病豬和帶毒豬是主要傳染源，無臨診癥狀有病理變化豬，或無臨診癥狀無病理變化陰性帶菌豬較多常見。MPS的診斷方法主要有細菌分離和鑒定，ELISA方法檢測抗體和PCR。PCR方法敏感性和特異性較好，是臨床病原學診斷中較為普遍的一種方法。但是從細菌分離培養到純化及DNA提取至少需要3-4天才能做出初步鑒定，不僅費時費力，結果也不準確，而且敏感性差，容易產生假陽性的結果，不利于養殖戶和規模化企業采取相應的血清型疫苗和藥物來進行及時的治療。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術存在的缺陷，提出的一種直接PCR檢測豬支原體肺炎病原的試劑盒及其應用，檢測迅速，靈敏性佳。

本發明通過以下技術方案解決技術問題：一種直接PCR檢測豬支原體肺炎病原的試劑盒，包含以下試劑：裂解液5μl，PCR擴增試劑20μl，陽性對照和陰性對照。

上述試劑的所述裂解液含有2～4M異硫氰酸酯、7～10M乙二胺四乙酸、15～20M十二烷基肌氨酸和3～6％體積比的聚乙烯基吡咯烷酮；所述PCR擴增試劑含有5×PCR Buffer、2.0M dNTP、10pM正向引物、10pM反向引物、高保真Taq酶5U/μl、20mM MgCl₂和純凈水。所述正向引物為MPSF：GAAGCTATCAAAAAAGGGGAAACTA，所述反向引物為MPSR：TGTATCGGTTTCAGAAGAAG。

本發明提供的試劑盒能快速、準確的檢測出豬支原體肺炎病原支原體。可對豬支原體肺炎感染的單個樣品檢測，也可對臨床病例中混合感染的檢測，可用于豬支原體肺炎病原普查、分子流行病學調查及疫苗篩選和監測。

本發明進一步提供一種直接PCR檢測豬支原體肺炎病原的試劑盒的應用，包括以下步驟：

第一步、樣品的采集，分為病料和鼻咽拭子采集，所述病料采集為無菌條件下采集病料0.1mg～100mg，裝入無RNA酶污染的離心管中備用，所述鼻咽拭子采集為采集鼻咽液，裝入無RNA酶污染的離心管中備用；

第二步、樣品裂解，取液體狀樣品10μl～100μl或研磨后的固體狀樣品0.1mg～100mg，加400～600μl裂解液，震蕩混勻；

第三步、直接PCR反應，反應體系為25μl，取裂解后的樣品5μl，加入PCR擴增試劑20μl，充分混合均勻后短暫離心，PCR擴增程序為95℃3min；然后35個循環：94℃1min，55℃1min，72℃1min S；最后72℃10min；

第四步、PCR產物的檢測，取5μl擴增產物和2μl Loading Buffer混勻，加到含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，同時加入對照和DNAMarker(DL 2000),電壓為120V，電泳30min，然后在凝膠成像儀中觀察結果。