[發明專利]一種直接PCR檢測豬接觸傳染性胸膜肺炎病原的試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710089474.1
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN106755523A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 李海利;郎利敏;方劍玉;王克領;張立憲;游一;侯自花
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司32102
• 代理人: 何朝旭,朱磊

1.一種直接PCR檢測豬接觸傳染性胸膜肺炎病原的試劑盒，包含以下試劑：裂解液，PCR擴增試劑，陽性對照和陰性對照。

2.根據權利要求1所述直接PCR檢測豬接觸傳染性胸膜肺炎病原的試劑盒，其特征在于：所述裂解液含有2～4M異硫氰酸酯、7～10M乙二胺四乙酸、15～20M十二烷基肌氨酸和3～6％體積比的聚乙烯基吡咯烷酮；所述PCR擴增試劑含有5×PCR Buffer、2.0M dNTP、10pM正向引物、10pM反向引物、高保真Taq酶5U/μl、20mM MgCl₂和純凈水。

3.根據權利要求2所述直接PCR檢測豬接觸傳染性胸膜肺炎病原的試劑盒，其特征在于：所述正向引物為APPF：CAAGCTATCAAATAAGGCGAAACTA，所述反向引物為APPR：AGTATCCGTATCAGAAGAAG。

4.一種直接PCR檢測豬接觸傳染性胸膜肺炎病原的試劑盒的應用，包括以下步驟：

第一步、樣品的采集，分為病料和鼻咽拭子采集，所述病料采集為無菌條件下采集病料0.1mg～100mg，裝入無RNA酶污染的離心管中備用，所述鼻咽拭子采集為采集鼻咽液，裝入無RNA酶污染的離心管中備用；

第二步、樣品裂解，取液體狀樣品10μl～100μl或研磨后的固體狀樣品0.1mg～100mg，加400～600μl裂解液，震蕩混勻；

第三步、直接PCR反應，反應體系為25μl，取裂解后的樣品5μl，加入PCR擴增試劑20μl，充分混合均勻后4000rpm離心10秒，陽性對照和陰性對照分別取5μl加入20μl PCR擴增試劑，PCR擴增程序為95℃5min；然后30個循環：94℃1min，55℃1min，72℃1min最后72℃5min；

第四步、PCR產物的檢測，取5μl擴增產物和2μl LoadingBuffer混勻，加到含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，同時加入DNAMarker(100bp),電壓為150V，電泳30min，然后在凝膠成像儀中觀察結果，當樣品擴增出260bp條帶，即樣品為陽性，陽性對照擴增出260bp條帶，陰性對照沒有條帶。

5.根據權利要求4所述直接PCR檢測豬接觸傳染性胸膜肺炎病原的試劑盒的應用，其特征在于：所述第三步中的反應體系為25μl，裂解后的樣品5μl，10pmol/μl的正向引物2μl，10pmol/μl的反向引物2μl，5×PCR Buffer 5μl，2.0mM/L dNTPs5μl，5U/μl的高保真Taq酶0.5μl，20mM MgCl₂ 3.5μl,純凈水2μl，充分混合均勻后離心。

6.根據權利要求5所述用于豬接觸傳染性胸膜肺炎病原直接PCR檢測的試劑盒的應用，其特征在于：擴增長度為250bp。

7.根據權利要求4所述直接PCR檢測豬接觸傳染性胸膜肺炎病原的試劑盒的應用，其特征在于：所述第四步中瓊脂糖凝膠電泳時的凝膠濃度為1.0％，其中含有1％的凝膠燃料。