[發明專利]一種核酸擴增的檢測方法

有效

• 申請號: 201710089047.3
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN106967790B
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 吳堅;王柳;應義斌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

本發明提供了一種核酸擴增的檢測方法，在第一PCR管加入反應擴增液，在第二PCR管加入鈣黃綠素和MnO₂納米材料，在第三PCR管加入焦磷酸鹽溶液；試紙條探針分別放置在第二PCR管和第三PCR管中，或者，在第一PCR管放入抗原修飾的引物；以具有三個接口的可視化核酸擴增檢測裝置作為蓋，將三個PCR管分別密封連到可視化核酸擴增檢測裝置的三個接口上，反應結束后，將反應擴增液，鈣黃綠素，MnO₂和焦磷酸鹽溶液混合，本發明通過判斷混合液的顏色是否為黃綠色判斷混合均勻，然后再進行試紙條檢測核酸恒溫擴增結果，能在不開蓋的情況下監控試紙條檢測前樣品混勻程度，使采用試紙條檢測的結果更加準確。

技術領域

本發明屬于核酸分析與檢測領域，具體涉及一種核酸擴增產物的可視化檢測方法。

背景技術

核酸擴增技術在當今的分析檢測領域具有十分重要的意義。食品安全檢測、環境監控、醫療診斷、法醫鑒定等領域無不依賴于核酸擴增技術。最早也是最經典的核酸擴增技術是在耐熱性聚合酶的作用下，依靠溫度的不斷循環交替而實現模板變性、引物退火及延伸從而實現目標產物的大量積累，這種技術被稱作聚合酶鏈式反應(PCR)。然而，PCR最大的缺陷也就在于，其不斷的溫度變化過程對儀器(PCR儀)提出了相對高的要求，并進而限制了其擴增速率。恒溫擴增的出現徹底擺脫了對精密溫控設備的依賴，僅僅一個熱塊、一臺水浴鍋甚至一只保溫效果良好的保溫瓶、熱水瓶等即可滿足反應需求。常見的恒溫擴增技術包括：環介導等溫擴增(LAMP)、重組聚合酶擴增(RPA)、鏈置換擴增(SDA)、依賴解旋酶的擴增(HDA)、切口酶介導的擴增反應(NEAR)等等。恒溫擴增的出現為現場快速檢測提供了十分大的便利。

然而，一個重要問題仍然限制核酸擴增現場快速檢測，即對擴增產物的快速特異性檢測。鈣黃綠素通常用于核酸恒溫擴增產物的可視化檢測，但是常用的方法是在核酸擴增液中添加Mn²⁺猝滅鈣黃綠素的熒光。隨著核酸擴增的進行，釋放大量的焦磷酸鹽的時候，焦磷酸鹽由于與Mn²⁺的結合作用更強，從而使鈣黃綠素脫離Mn²⁺，熒光恢復。這種方法除了檢測結果不夠特異以外，Mn²⁺的引入也會對擴增本身有較大的抑制作用。同時，對于擴增效率比較低的樣本其本身焦磷酸鹽產生的量就不多，因而鈣黃綠素的熒光恢復不明顯。同時由于反應本身產生的焦磷酸鹽并不會足夠多，所以對鈣黃綠素和Mn²⁺的用量提出了嚴格的要求。

可視化試紙條用于核酸擴增檢測具有特異、方便、快速、結果可靠、成本低廉等優點。但是，利用試紙條對核酸擴增結果進行檢測通常需要較大體積(通常50-200μL)檢測液體，以便擴增分子在試紙條上順暢而快速的流動。但是在利用試紙條對核酸擴增結果進行檢測的過程中，往往有幾個方面的因素限制了擴增產物直接用于試紙條檢測，必須通過對擴增產物進行稀釋后才能用于試紙條檢測，如：(1)反應試劑體積的增大往往意味著反應成本驟增；(2)核酸擴增反應試劑中經常含有某些試劑(如PEG，PVA等)導致擴增體系的過于黏稠，影響樣品分子在試紙條上的涌動，造成檢測結果的不準確；(3)某些通過探針檢測的體系必須在反應后加入探針、緩沖溶液；(4)擴增產物量太大，超出所設計紙條的檢測范圍，造成鉤狀效應；等等。這些因素的存在都要求試紙條檢測過程中必須加入額外的試劑以保證檢測結果的準確性。然而在開蓋操作的情況下，擴增產物容易形成氣溶膠污染，影響后續檢測結果的準確性。針對此問題，目前有多種檢測裝置，發明人開發出了一種裝置(ZL 2015 20424418.5)，能夠在不開蓋的情況下實現對擴增產物的稀釋。

但是，依靠這些裝置，稀釋過程中樣品的混合均勻程度對檢測結果仍然有很大的影響，如果樣品沒有混合均勻將直接影響檢測結果的準確性。而如何判斷樣品是否混合均勻卻是一個難題。因此，本發明利用鈣黃綠素的熒光猝滅效果，結合核酸試紙條的檢測特異性，提出了一種利用鈣黃綠素檢測核酸擴增產物混合均勻程度的方法，進一步保障核酸試紙條檢測結果的準確性。

發明內容