[發明專利]一種單克隆抗體的篩選方法及其應用

在審

• 申請號: 201710085557.3
• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN108456682A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 孫穎;陳維之;孫中平
• 申請（專利權）人: 蘇州金唯智生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/63;C07K16/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種與目的抗原具有高親和力的單克隆抗體的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）構建抗體文庫，并對該抗體文庫進行高通量測序；

（2）獲取針對目的抗原的抗體可變區基因譜；

（3）從抗體可變區基因譜中選取CDR3序列及對應的重鏈和輕鏈抗體核酸序列作為候選配對序列；

（4）分別構建重鏈和輕鏈表達載體，混合配對后利用合適的細胞轉染技術和表達系統進行抗體表達，對表達產物進行活性檢測，得到陽性組合；

（5）將陽性組合中的重鏈和輕鏈進行拆分，按照1條重鏈與1條輕鏈的原則配對，利用合適的細胞轉染技術和表達系統進行抗體表達，對表達產物進行活性檢測，得到的陽性組合即為與目的抗原具有高親和力的單克隆抗體。

2.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟（4）中的混合配對方式包括如下步驟：

（a）將構建好的重鏈表達載體，每m條進行等量混合；

（b）將構建好的輕鏈表達載體，每n條進行等量混合；

（c）步驟（a）中的重鏈混合物分別與步驟（b）中的輕鏈混合物配對；

其中m、n均取大于等于1的整數。

3.根據權利要求1或2所述的篩選方法，其特征在于，步驟（5）中將陽性組合中的重鏈和輕鏈進行拆分后，若原陽性組合中重鏈和輕鏈的數目均大于1，先按照1條重鏈與多條輕鏈和/或1條輕鏈與多條重鏈的原則配對，利用合適的細胞轉染技術和表達系統進行抗體表達，對表達產物進行活性檢測，再將得到的陽性組合中的重鏈和輕鏈進行拆分，按照1條重鏈與1條輕鏈的原則配對，利用合適的細胞轉染技術和表達系統進行抗體表達，對表達產物進行活性檢測，得到的陽性組合即為與目的抗原具有高親和力的單克隆抗體。

4.根據權利要求1-3任一所述的篩選方法，其特征在于，步驟（4）-（5）中所述的細胞轉染技術依靠DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法、陽離子脂質體法、陽離子聚合物法、顯微注射法、基因槍法以及電穿孔法中的任意一種或幾種方法來實現。

5.根據權利要求1-3任一所述的篩選方法，其特征在于，步驟（4）-（5）中所述的表達系統選自大腸桿菌表達系統、酵母表達系統、昆蟲表達系統以及哺乳動物表達系統中的任意一種或幾種。

6.根據權利要求1-3任一所述的篩選方法，其特征在于，步驟（4）-（5）中所述的活性檢測方法選自ELISA、IF、PHA以及RIA中的任意一種或幾種。

7.根據權利要求1-3任一所述的篩選方法，其特征在于，步驟（4）中所述的載體構建方法選自酶切連接、同源重組中的任意一種或幾種。

8.根據權利要求1-3任一所述的篩選方法，其特征在于，步驟（4）中所述的混合方式是重鏈表達載體與輕鏈表達載體以一定的質量比進行混合，混合的比例可以根據重鏈和輕鏈的條數進行相應調整。

9.根據權利要求1-3任一所述的篩選方法，其特征在于，步驟（3）中所述選擇CDR3序列的原則為：選擇CDR3聚類后的高頻序列、免疫后或爆發期比與免疫前或恢復期出現頻率有明顯提升的CDR3序列或CDR3對應的V基因家族在免疫后或爆發期較免疫前或恢復期存在明顯差異的序列中的任意一種或幾種。

10.根據權利要求1-9任一所述單克隆抗體的篩選方法在生物學、免疫學、醫學以及相關領域中的應用。