[發明專利]人羊膜上皮干細胞庫的構建方法

有效

• 申請號: 201710085128.6
• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN106801032B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 龐希寧;施萍;趙峰;郎宏鑫
• 申請（專利權）人: 沈陽艾米奧生物工程技術研發中心有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/073;G01N33/68;G01N15/14
• 代理公司: 沈陽智龍專利事務所(普通合伙) 21115
• 代理人: 宋鐵軍

本發明涉及一種人羊膜上皮干細胞庫的構建方法。其方法是取人羊膜，用胰蛋白酶消化后，過濾制成單細胞懸液；在DMEM／F12培養基中添加人表皮細胞生長因子、人轉鐵蛋白、人胰島素、亞硒酸鈉、丙氨酰?L?谷氨酰胺二肽、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和絲氨酸，使細胞在無血清條件下，置于37℃、飽和濕度、體積分數為5％的CO₂培養箱中培養，換液和傳代。將體外培養和擴增獲得細胞置液氮冷凍保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建人羊膜上皮干細胞庫。本發明儲存人羊膜上皮干細胞，其具有來源廣泛、不受倫理限制的特點，細胞培養和儲存介質無動物源性。可提供上皮干細胞進行細胞治療及其他應用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域的一種干細胞庫的構建方法，具體涉及的是一種人羊膜上皮干細胞庫的構建方法。

背景技術

隨著經濟的發展，人民生活水平的提高，原先威脅人類健康的最大殺手——“傳染病”在逐漸減少，而由于細胞、組織及器官損傷、病變及老化而引起的疾病逐漸增多。這些疾病僅僅靠傳統的藥物和醫療手段是不能解決的，而干細胞治療將有望成為治療這類疾病的主要手段。干細胞的自我更新和分化多能性的特點使之成為疾病發病機制研究，藥物篩選以及細胞移植的理想對象和來源。干細胞治療有望治療細胞、組織及器官損傷、病變及老化而引起的疾病。

細胞治療實現產業化過程步驟包括細胞分離、培養、鑒定、建庫、大量擴增、規模化生產等，構建人羊膜上皮干細胞庫是實現轉化醫學研究，即臨床細胞治療的重要環節之一，建庫是實現規模化生產先決條件。目前，細胞治療需要提供細胞的來源主要為骨髓，但成人骨髓源干細胞數量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且供者骨髓細胞的采集須行骨髓穿刺術，來源受到限制。

人羊膜上皮干細胞(human amniotic epithelial stem cells，簡稱hAESCs)是胎盤羊膜組織靠近胎兒側的單層上皮細胞，來源于胚外外胚層。具有類似胚胎干細胞的多向分化潛能，及更好的外胚層分化潛能。屬于多潛能干細胞，可分化成心肌樣細胞、脂肪細胞和成骨細胞等。hAESCs含量豐富，分化能力強，可在體外進行分離、培養和擴增，且生物性能穩定，多次傳代擴增仍能保持旺盛功能，可以為實驗和臨床提供充足的細胞來源；hAESCs不表達MHC-Ⅱ類抗原，僅表達少量的MHC-Ⅰ類抗原，由于其不合成端粒酶，hAESCs植入體內并不形成畸胎瘤，hAESCs可產生許多細胞因子，有利于創傷的修復，適宜于不同個體之間的移植，也是細胞治療的理想靶細胞。在干細胞治療的安全性方面較一般干細胞更具臨床應用潛力。具有比骨髓干細胞更強的擴增能力和免疫原性及成瘤性更低等骨髓干細胞無法比擬的優點。因此，構建國內外首個無血清培養細胞的“羊膜上皮干細胞庫”，可為臨床細胞治療提供種子細胞庫。

由于hAESCs來源豐富，成本低廉，取材方便，為非創傷性，無倫理學問題，因此人羊膜上皮干細胞在臨床疾病治療中的作用也已在動物實驗和人類疾病的治療中取得進展和證實。這些疾病包括A1zheimer病(癡呆癥)、脊髓損傷、中風、燒傷、心臟病、糖尿病、骨關節炎和類風濕性關節炎等。應用前景十分廣闊。

經專利檢索比對發現申請專利號CN104480533A公開“一種胎盤干細胞庫的構建方法及胎盤組織復蘇方法”雖提及人羊膜上皮干細胞，但由于其細胞培養技術手段的局限性，例如在細胞培養基中仍含有異種胎牛血清等實際問題的存在，始終存在著臨床應用生物安全隱患，長期以來一直困擾著人們無法從根本上得以解決，無法在臨床上推廣應用。如何研究發現用多種細胞因子和氨基酸等細胞營養成分培養基代替含異種胎牛血清的細胞培養hAESCs是非常復雜困難的開辟性工作。需要研究人員作大量反復的科學實驗才有解決。

發明內容

本發明針對上述現有干細胞來源或者受倫理限制或數量有限的問題，而提供一種來源廣泛、同種異體、不受倫理限制及無免疫原性問題的人羊膜上皮干細胞庫的構建方法。同時，本發明還解決了以往人羊膜上皮干細胞庫在臨床應用方面所存在的安全隱患等問題，采用無血清培養基，不含異種動物原成分，以滿足臨床應用安全可靠的要求，有利于臨床推廣應用。