[發(fā)明專利]一種接受外源基因定點(diǎn)整合的基因工程細(xì)胞系

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710084033.2
• 申請(qǐng)日: 2017-02-16
• 公開（公告）號(hào): CN108441478A
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李生偉;高小平;張晟;付偉;王雯茜;代燕平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都貝愛特生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明涉及外源基因定點(diǎn)整合的工程細(xì)胞系及其用途。該細(xì)胞系利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)作為宿主細(xì)胞通過(guò)插入識(shí)別標(biāo)簽在其Z4q3區(qū)而獲得。本發(fā)明工程細(xì)胞系支持外源基因的定點(diǎn)整合，并長(zhǎng)期維持外源蛋白的高效和穩(wěn)定表達(dá)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞基因工程領(lǐng)域，具體涉及定點(diǎn)整合外源基因的CF細(xì)胞系及其在蛋白表達(dá)的用途。

背景技術(shù)

提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞外源基因表達(dá)水平和穩(wěn)定性，一直是生物制藥領(lǐng)域或基因工程領(lǐng)域不斷發(fā)展的需求。盡管大多數(shù)商業(yè)化表達(dá)體系尤其表達(dá)載體都有針對(duì)性的優(yōu)化設(shè)計(jì)，如選擇強(qiáng)啟動(dòng)子，帶有加壓篩選系統(tǒng)等，但獲得高表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞仍然需要耗費(fèi)巨大的精力和成本。通過(guò)常規(guī)技術(shù)引入外源基因的整合具有隨機(jī)性，插入位置不支持強(qiáng)轉(zhuǎn)錄發(fā)生，并導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平較低，即使短時(shí)的高水平表達(dá)，但也不能維持其穩(wěn)定性，并隨傳代次數(shù)增加表達(dá)水平逐漸下降。因此，外源基因插入染色體的“位置效應(yīng)”以及整合位點(diǎn)是否在高轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)等被提出是影響蛋白表達(dá)水平及其穩(wěn)定性的重要因素。只有對(duì)目的基因?qū)嵤┒ㄏ蛘先缯现粱蚪M的特定位置，才可能實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定整合和蛋白高水平表達(dá)。

外源基因定向整合方法有多種，包括同源重組技術(shù)衍生的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，依靠針對(duì)特異識(shí)別位點(diǎn)的整合酶，在基因組和外源DNA間實(shí)現(xiàn)基因置換、基因敲出及敲入等基因工程操作。由于能夠有效克服靶向性低、隨機(jī)整合以及位置效應(yīng)影響等缺點(diǎn)，定點(diǎn)整合技術(shù)在基因工程領(lǐng)域中的應(yīng)用已為外源基因靶向定點(diǎn)整合奠定了良好基礎(chǔ)。從20世紀(jì)80年代發(fā)展至今，位點(diǎn)特異性重組技術(shù)已有多種，其中最成熟的技術(shù)為FLP/FRT系統(tǒng)和Cre/loxP系統(tǒng)。FLP/FRT技術(shù)在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用開始于20世紀(jì)90年代初期。O’Gorman等應(yīng)用FLP重組酶技術(shù)實(shí)現(xiàn)了將外源基因整合進(jìn)入預(yù)先確定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體位點(diǎn)(Science.1991Mar 15；251:1351-5.Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells)；Wiberg FC等應(yīng)用FLP/FRT技術(shù)將編碼抗體的基因整合進(jìn)入CHO細(xì)胞基因組，首先在CHO細(xì)胞基因組特定位點(diǎn)插入1個(gè)FRT位點(diǎn)，建立含有單個(gè)FLP重組酶識(shí)別位點(diǎn)的宿主細(xì)胞系，然后將同樣含有單個(gè)FRT位點(diǎn)的抗體表達(dá)載體以及FLP重組酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，編碼抗體的基因在FLP重組酶的作用下，定點(diǎn)整合在細(xì)胞基因組的相同位點(diǎn)，有效克服了位置效應(yīng)對(duì)抗體表達(dá)水平的影響(BiotechnolBioeng.2006,94:396-405.Production of target-specific recombinant humanpolyclonal antibodies in mammalian cells.)。目前，通過(guò)FLP/FRT技術(shù)已推出系列商業(yè)化細(xì)胞系，包括Flp-In^TM-293、Flp-In^TM-CV-1、Flp-In^TM-CHO、Flp-In^TM-BHK和Flp-In^TM-3T3等，這些細(xì)胞系均可借助重組酶體系完成細(xì)胞基因組與外源DNA的位點(diǎn)特異性重組。然而，所述細(xì)胞系均為貼瓶生長(zhǎng)，作為產(chǎn)業(yè)化用途尤其在表達(dá)治療性蛋白或治療性單克隆抗體方面的運(yùn)用具有很大的局限性。中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)枺?00310115022.4)公開了一種CHO/dhfr-細(xì)胞定點(diǎn)整合表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在CHO/dhfr-細(xì)胞基因組中定點(diǎn)整合和有效表達(dá)。PCT專利(2012)公開了一種染色體著陸墊(chromosomal landing pad)及其相關(guān)用途，尤其公開了強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)位于宿主細(xì)胞的Ank2、Cpsf4、C-Mos、Nephrocystin-1/Mal基因之內(nèi)或附近的染色體著陸墊，這些染色體“著陸墊”均借助FLP/FRT技術(shù)實(shí)現(xiàn)，并成功用于外源基因的定點(diǎn)整合。中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)枺?01510130235.7)公開了一種CHO細(xì)胞定點(diǎn)整合表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在細(xì)胞染色體基因組中1q12及1q13區(qū)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合和高效表達(dá)。