[發明專利]一種小鼠腸道固有層原代樹突狀細胞的分離方法

有效

• 申請號: 201710083902.X
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號: CN106754711B
• 公開（公告）日: 2020-03-10
• 發明（設計）人: 劉頌;管文賢;任建安;王革非;王萌;汪灝
• 申請（專利權）人: 南京鼓樓醫院
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;夏平

本發明公開了一種小鼠腸道固有層原代樹突狀細胞的分離方法。包括將腸管剪切為10?12cm的腸段，洗脫腸管表面雜質和腸管表面粘液后，以含EDTA和EGTA的消化液B洗脫腸上皮細胞層，再以含Liberase TL和DNase I的消化液C消化；最后以流式細胞儀進行分選得到小鼠腸道固有層原代樹突狀細胞。利用本發明所述方法分離得到的原代樹突狀細胞純度較高、表型特征完整。

技術領域

本發明屬于生物領域，涉及一種小鼠腸道固有層原代樹突狀細胞的分離方法。

背景技術

腸道主要由上皮層、固有層及漿膜層構成，其中上皮層主要為一層扁平上皮細胞，而固有層內含有種類豐富、數目繁多的免疫細胞，是哺乳動物識別、捕獲經消化道進入體內的外界病原微生物的重要場所，腸道固有層免疫紊亂與感染、腫瘤、炎癥性腸病等多種疾病密切相關。樹突狀細胞是最重要的免疫細胞之一，針對樹突狀細胞的研究有助于提升抗感染、抗腫瘤等臨床診療水平，改善廣大患者的預后。對腸道固有層中的原代樹突狀細胞進行分離、純化是開展此類研究的前提條件之一。

當前原代細胞分離的主要方法包括：機械解離法、酶學解離法與螯合劑解離法。機械解離法多采用剪刀剪切、吸管吹打、注射針頭或紗網擠壓過濾等方法分散組織細胞。此法雖然簡便快速，但對細胞的機械損傷過大、分散效果差，因此極少用于原代細胞的分離。酶學解離法多使用胰蛋白酶或膠原酶，利用酶對細胞間質或細胞間連接的消化作用，達到使原代細胞分離的目的，但此方法具有消化時間長(對細胞的潛在毒性大)、酶濃度與活力欠穩定、對環境溫度及PH要求高等不足，因此適用范圍偏窄。螯合劑解離法常使用EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)，EDTA能夠與細胞表面的鈣、鎂等二價離子結合形成螯合物，結合后的機械力能夠使細胞變圓而分離。該法具有解離時間短、解離效應穩定、對環境要求低(不需要恒溫、恒定PH等)等優勢，尤其適用于上皮細胞的解離，但對原代細胞的損傷程度大于酶學解離法。另外，在原代細胞分離過程中，由于部分組織細胞被破壞，釋放出核內的染色質，這些染色質具有很強的粘性，導致原代細胞間顯著粘連，甚至形成膠凍狀，嚴重阻礙細胞的進一步解離。

目前分離固有層細胞的主要方法是將小腸剪切為3-4cm片段，再加入消化酶(如膠原酶IV)或螯合劑(如EDTA)對細胞進一步分離。此方法的弊端包括：①對小腸多次剪切導致機械性損傷過大；②未將上皮層、固有層與漿膜層的細胞逐一消化，混合消化勢必造成上皮層與漿膜層細胞對固有層細胞干擾過大、固有層細胞純度顯著降低；③樹突狀細胞具有敏感、脆弱、易死亡等特點，單純酶學解離法消化時間過長、單純螯合劑解離法細胞損傷過重，因此均難以達到滿意效果。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種小鼠腸道固有層原代樹突狀細胞的分離方法。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

一種小鼠腸道固有層原代樹突狀細胞的分離方法，包括將腸管剪切為10-12cm的腸段，洗脫腸管表面雜質和腸管表面粘液后，以含EDTA和EGTA的消化液B洗脫腸上皮細胞層，再以含Liberase TL和DNase I的消化液C消化；最后以流式細胞儀進行分選得到小鼠腸道固有層原代樹突狀細胞。

一種小鼠腸道固有層原代樹突狀細胞的分離方法，優選包括如下步驟：

(1)將腸管剪切為每段長10-12cm的腸段，用聚乙烯細管將腸管翻轉并用細線結扎固定，使腸管腸上皮細胞層暴露，并浸泡在裝有平衡鹽溶液B的試管中，并多次搖晃試管、更換平衡鹽溶液B以洗脫腸管表面雜質；

(2)將平衡鹽溶液B更換為消化液A，搖晃試管以洗脫腸管表面粘液；

(3)將消化液A更換為平衡鹽溶液B，使用平衡鹽溶液B再次清洗腸管多次，以中和消化液A；