[發(fā)明專利]基于RPA技術(shù)檢測菜豆莢斑駁病毒的方法、RPA引物及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710083623.3
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號(hào): CN106755592A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張永江;相寧;魏霜;付偉;劉建華;李桂芬;魏梅生
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 深圳國新南方知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司44374
• 代理人: 黃建才,崔春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別涉及檢測菜豆莢斑駁病毒的RPA方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)

菜豆莢斑駁病毒是危害大豆等豆科植物的重要病毒，在我國目前并無此病毒的分布，其主要發(fā)生于美國、加拿大、巴西、秘魯、厄瓜多爾等大豆產(chǎn)區(qū)，自然寄主有大豆、豇豆、菜豆，實(shí)驗(yàn)寄主有20屬25種植物，可以通過汁液接種傳播、甲蟲傳播和種子遠(yuǎn)距離傳播。

根據(jù)病毒侵染時(shí)間的不同，該病毒能夠造成3％至52％的產(chǎn)量損失并降低大豆品質(zhì)，如與大豆花葉病毒混合侵染，可造成高達(dá)85％的大豆產(chǎn)量損失，一旦傳入我國并定殖下來，將很難根除，會(huì)對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失。因此，該病毒已被列入我國新修訂的植物檢疫性有害生物名單中，由于目前尚無有效的病毒防治方法，因此加強(qiáng)出入境檢驗(yàn)檢疫工作是防止這種病毒傳入的最有效的途徑之一。

我國每年從國外進(jìn)口大量的大豆，為防止該危險(xiǎn)性病毒的傳入，必須加強(qiáng)開發(fā)該病毒的快速檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏、準(zhǔn)確、簡便和快速的基于RPA技術(shù)的檢測菜豆莢斑駁病毒的方法，本發(fā)明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高、檢測時(shí)間短、不需要特殊的儀器和適用范圍廣的RPA引物和含有該RPA引物的試劑盒。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明第一方面提供了一種引物對，其中一條引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一條引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明第二方面提供了所述的引物對在檢測或輔助檢測菜豆莢斑駁病毒，或制備檢測或輔助檢測菜豆莢斑駁病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

在一優(yōu)選例中，所述檢測或輔助檢測菜豆莢斑駁病毒包括：檢測或輔助檢測待測植物樣品是否感染菜豆莢斑駁病毒，以及檢測或輔助檢測待測病毒是否為或候選為菜豆莢斑駁病毒；

在一優(yōu)選例中，所述制備檢測或輔助檢測菜豆莢斑駁病毒的產(chǎn)品包括：制備檢測或輔助檢測待測植物樣品是否感染菜豆莢斑駁病毒的產(chǎn)品，以及制備檢測或輔助檢測待測病毒是否為或候選為菜豆莢斑駁病毒的產(chǎn)品。

本發(fā)明第三方面提供了一種試劑盒，包括所述的引物對。

在一優(yōu)選例中，還包括RPA恒溫?cái)U(kuò)增試劑；

在一優(yōu)選例中，所述RPA恒溫?cái)U(kuò)增試劑包括來自TwistDX公司的RPA擴(kuò)增試劑盒TwistAmp Basic kits所包含的試劑。

在一優(yōu)選例中，還包括植物總RNA提取試劑。

在一優(yōu)選例中，所述植物總RNA提取試劑包括來自天根生物科技有限公司貨號(hào)為DP432的植物總RNA提取試劑盒所包含的試劑。

在一優(yōu)選例中，還包括反轉(zhuǎn)錄試劑。

在一優(yōu)選例中，所述反轉(zhuǎn)錄試劑包括來自TaKaRa的貨號(hào)為RR014A的PrimeScript RT-PCR Kit所包含的試劑。

本發(fā)明第四方面提供了一種試劑盒在檢測或輔助檢測菜豆莢斑駁病毒，或制備檢測或輔助檢測菜豆莢斑駁病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

在一優(yōu)選例中，所述檢測或輔助檢測菜豆莢斑駁病毒包括：檢測或輔助檢測待測植物樣品是否感染菜豆莢斑駁病毒，以及檢測或輔助檢測待測病毒是否為或候選為菜豆莢斑駁病毒；

在一優(yōu)選例中，所述制備檢測或輔助檢測菜豆莢斑駁病毒的產(chǎn)品包括：制備檢測或輔助檢測待測植物樣品是否感染菜豆莢斑駁病毒的產(chǎn)品，以及制備檢測或輔助檢測待測病毒是否為或候選為菜豆莢斑駁病毒的產(chǎn)品。

本發(fā)明第五方面提供了一種檢測或輔助檢測菜豆莢斑駁病毒的方法，包括使用所述的引物對或所述試劑盒的步驟。

在一優(yōu)選例中，所述檢測或輔助檢測菜豆莢斑駁病毒包括：檢測或輔助檢測待測植物樣品是否感染菜豆莢斑駁病毒；以及檢測或輔助檢測待測病毒是否為或候選為菜豆莢斑駁病毒。

在一優(yōu)選例中，所述的方法包括如下步驟：

1)RPA擴(kuò)增

從待測植物樣品或待測病毒中提取總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板與所述的引物對或所述試劑盒進(jìn)行RPA擴(kuò)增。

2)根據(jù)RPA擴(kuò)增的結(jié)果判斷待測植物樣品是否感染菜豆莢斑駁病毒，或待測病毒是否為或候選為菜豆莢斑駁病毒；

在一優(yōu)選例中，所述RPA擴(kuò)增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：

若所述RPA擴(kuò)增得到的RPA擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為198bp的片段，則所述待測植物樣品感染菜豆莢斑駁病毒，或待測病毒為或候選為菜豆莢斑駁病毒；